腎母細胞瘤血清蛋白質標志物的篩選及鑒定.pdf

1、研究背景:腎母細胞瘤或稱腎胚胎瘤,又稱Wilm’s瘤(WT),是小兒最常見的惡性實質性腫瘤之一。目前認為分期及分型是影響預后的重要因素,與腫瘤大小無關。早期診斷對腎母細胞瘤的治療以及患兒的預后具有重大意義。
　　現(xiàn)階段臨床上診斷腎母細胞瘤主要依靠臨床癥狀結合超聲、IVU、CT等檢查,多數(shù)病例雖術前可確診,但是因未能及早發(fā)現(xiàn)就診而誤失治療時機影響預后。因此,尋找一種可行的能夠早期診斷腎母細胞瘤的方法對其治療和預后是十分重要的。隨著蛋

2、白質組學的發(fā)展,理想的血清蛋白質標志物作為早期篩查和診斷指標值得關注和研究。蛋白質組學技術可高通量快速的篩檢腫瘤不同發(fā)生階段基因表達的蛋白質表達譜,從而發(fā)現(xiàn)大量有診斷價值的蛋白質標志分子,而這些蛋白能夠為腫瘤治療提供靶點,為早期診斷提供有效腫瘤標志。2002年誕生的表面增強激光解吸電離飛行時間質譜(surface-enhanced laser desorption/ionization-time of flight-massspectr

3、um,SELDI-TOF-MS)蛋白質芯片技術已廣泛用于各類疾病特異性生物標志物的檢測和篩選,并取得了一系列突破性進展。SELDI-TOF-MS技術作為一項新的蛋白質組學研究方法,具有樣品用量小、操作簡便、靈敏度高、高通量等優(yōu)點,通過結合MALDI-TOF-MS、LC-MS/MS等技術已經(jīng)鑒定出了乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等腫瘤血清中的相關特異性蛋白。迄今為止對小兒腎母細胞瘤的相關特異性蛋白的鑒定尚未見文獻報道。
　　本研究應用表面增

4、強激光解析電離飛行時間質譜(SELDI-TOF-MS)技術檢測腎母細胞瘤患兒手術前后及正常小兒血清蛋白質組,篩選出特異的蛋白質標志物,并用質譜鑒定技術對篩選出特異的蛋白質標志物進行鑒定。研究目的篩選腎母細胞瘤特異性血清蛋白質標志物并對其進行鑒定,以期確定其作為腎母細胞瘤血清學診斷和預后監(jiān)測的特異標志物。
　　材料與方法:1.臨床資料血清標本130例均來自鄭州大學第一附屬醫(yī)院小兒外科,其中腎母細胞瘤術前標本30例(Ⅰ期6例、Ⅱ期10

5、例、Ⅲ期10例、Ⅳ期4例),術后2周24例(行根治術21例、行姑息切除術3例),1例于術后兩月死亡,術后3個月和6個月各23例。正常對照組30例來自門診體檢的健康小兒,男21例,女9例,平均年齡(2.6±0.1)歲。30例腎母細胞瘤標本均經(jīng)免疫組化和2位以上病理學教授證實,其中男21例,女9例,年齡24 d~10歲,平均年齡(2.8±0.1)歲;進行手術后配對研究的24例患兒中男16例,女8例,平均年齡(2.2±0.1)歲,術前均未接受

6、放化療。正常對照組與腎母細胞瘤組年齡性別相配對。外周靜脈血標本均于清晨空腹時抽取,室溫下靜置1 h后3000 r/min離心10min,收集血清樣本,儲存于-80℃保存?zhèn)溆谩?.主要試劑和儀器3-[3-(膽酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸內鹽(CHAPS),尿素,二硫蘇糖醇(DTT),NaAC,芥子酸(SPA),胰蛋白酶均購自美國Promega公司。Ciphergen PBSⅡ+ SELDI-TOF-MS和WCX2蛋白質芯片購自美國Ciphe

7、rgen公司。乙腈、a-氰基-4-羥基肉桂酸(CHCA)、胰島素、細胞色素C、碘乙酰胺(IAM)、NH4HCO3均購自美國Sigma公司。SHIMADZU LC-10Avp高效液相色譜(HPLC)儀購自日本島津公司。基質輔助激光解吸附電離/飛行時間質譜(AXIMA-CFRTM plus MALDI-TOF-MS)購自英國Kratos Analytical公司。離心濃縮儀、液質聯(lián)用質譜儀(LC-MS/MS)均購自美國Thermo elec

8、tron公司。3.實驗方法:3.1、 SELDI蛋白質芯片操作:血清標本冰浴解凍,4℃離心;取96孔板置冰盒上,每孔加U9(9MUrea,2％CHAPS,1％DTT)10ul,血清5ul,4℃層析柜600r/min振蕩30min。震蕩結束前15min做芯片預處理,芯片裝入Bioprocessor中,記錄芯片號;每孔加醋酸鈉(100mmol/L PH4)200ul,層析;U9處理后的96孔板置冰上,排槍加醋酸鈉185 ul,層析;取已處理

9、的樣本100ul加入到芯片上,層析,甩去殘液,快速拍干。加醋酸鈉200 ul,振蕩,甩掉,拍干。200 ul去離子水200 ul沖洗、甩干。芯片風干后,每孔分兩次加入50％飽和SPA1 ul,干燥后上機待測。3.2、差異蛋白質峰的純化:于-80℃冰箱中取出血清樣本,冰水浴中解凍。解凍后,取血清100μl,加入350μl超純水,再加入700μl純乙腈。將上述混合液置入-20℃冰箱中,30min后取出,離心10min(13000r/min)

10、,上清液移入新試管置入SPD SpeedVac中凍干約20min。將凍干后的樣品上樣至HPLC中。收集不同時間的純化液。將純化出的蛋白液置入SPD SpeedVac中凍干至約20μl。將上述樣品與CHCA各取1.5μl,兩者混合后點樣至MALDI靶板,待干。同時用細胞色素C(相對分子質量12361.96)+CHCA和胰島素(相對分子質量5734.51)+CHCA校樣。將靶板置入MALDI-TOF-MS中檢測,找出SELDI-TOF-MS

11、所篩質荷峰值的特異樣本。3.3、酶解、質譜分析及數(shù)據(jù)庫檢索:將特異蛋白質樣品加超純水至容積40μl,再加入配好的濃度為0.1mol/L的DTT溶液4μl后,置于37℃溫水中水浴1h。向44μl的溶液中加入1.6μl的IAM后避光放置1h。再向45.6μl的溶液中依次加入1.6μl的1mol/L的DTT溶液、150μl的0.1mol/L的NH4HCO3溶液和2μl的胰蛋白酶,然后37℃溫水過夜。取經(jīng)酶解后的蛋白液上樣至毛細色譜柱后,采用L

12、C-MS/MS進行串聯(lián)質譜分析,分析得到的肽質量指紋圖譜(PMF)使用SEQUST檢索程序查詢Bioworks公司提供的蛋白質序列數(shù)據(jù)庫。4.數(shù)據(jù)收集與處理用已知分子量的蛋白芯片將SELDI-TOF-MS系統(tǒng)校正到分子量誤差<0.1％。將結合好蛋白質的WCX2蛋白質芯片用質譜閱讀儀分析。分析參數(shù):激光強度為170,靈敏度為6,每個樣本收集總點數(shù)140次。收集數(shù)據(jù)范圍1000~30000,優(yōu)化范圍2000~20000。以質控血清作重復性檢

13、測,其峰值大小和強度變異系數(shù)為0.05％和19.7％。數(shù)據(jù)用Proteinchip Software3.1校正。ZUCI-Protein Chip Data Analyze System軟件包分析,離散小波分析去除噪音,減掉基線。用局部極值的方法找出樣本各自的峰,并過濾掉信噪比小于2的峰。以10％為最小閾值做聚類分析,將各個樣本中m/z的差異小于0.3％的峰聚為一類。支持向量機分類器設置:采用徑向基核函數(shù),Gamma值設為0.6,罰分函

14、數(shù)(C)設為19。特征向量的選擇采用統(tǒng)計過濾結合模型依賴性篩選方法,建立判別模型,用留一法交叉驗證評估模型的判別效果。采用判別分析方法處理質譜數(shù)據(jù)對經(jīng)S處理得到的結果進行驗證。5.統(tǒng)計學處理質譜原始數(shù)據(jù)經(jīng)過濾噪音,聚類分析處理后,對初步篩選出的質荷比峰數(shù)據(jù)做Wilcoxon秩和檢驗。檢驗標準取α=0.01。
　　結果:1.SELDI-TOF-MS檢測:術前組和正常小兒組的質譜數(shù)據(jù)經(jīng)過初步過濾篩選和統(tǒng)計分析后得到P值小于0.01的m

15、/z峰11個,從差異顯著蛋白質峰的任意組合中,采用SVM篩選出預測值的youden指數(shù)(陽性率與陰性率之差)最高的組合模型,篩出m/z位于6455.5和6984.4的蛋白質標志物2個,在腎母細胞瘤組低表達(強度為1029.2±364.1、297.4±125.6),正常小兒組高表達(強度為2108.3±837.2,753.4±225.8),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。經(jīng)留一法交叉檢測,在測試集上判別該兩個標志物組合模型的特異性為10

16、0％,敏感度為100％。腎母細胞瘤手術前后組比較篩選到差異最顯著的m/z位于9190.8的蛋白質標志物,在術前組血清中低表達(強度為283.4±153.9),術后組中呈高表達(強度為5973.6±656.7),差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01);術后組和正常小兒組(表達強度為6231.0±519.4)間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.01)。2.差異蛋白質峰的純化:將6455.5、9190.8高表達的正常小兒血清分離純化后共收集到25管不同組分

17、的蛋白質液。經(jīng)MALDI-TOF-MS檢測,發(fā)現(xiàn)兩管蛋白質純化樣本分別是相對分子質量6455.5和9190.8的特異蛋白質。3.質譜分析及數(shù)據(jù)庫檢索:酶解上述兩管的蛋白質樣品后,采用LC-MS/MS測定該蛋白質的酶解肽段,將檢測得到的PMF經(jīng)過SEQUST檢索程序查詢Bioworks公司提供的蛋白質序列數(shù)據(jù)庫,查得其對應可能的蛋白質為:6455.5為載脂蛋白CⅢ,所檢測到的肽段氨基酸序列與數(shù)據(jù)庫中的人APO CⅢ序列匹配率為56.6％;