唐氏綜合征小鼠神經(jīng)元凋亡相關蛋白的篩選與驗證.pdf

1、背景:
　　唐氏綜合征（Down’s syndrome，DS）是最常見的染色體疾病和出生缺陷，其多余的一條21號染色體阻礙了兒童的生長發(fā)育，并且造成嚴重的神經(jīng)功能缺陷。DS患者的神經(jīng)功能缺陷不僅會造成認知能力的丟失，還能導致早發(fā)性老年性癡呆的發(fā)生。因此，加強DS神經(jīng)缺陷的研究，對延緩其腦損傷、改善認知能力、提高生活質(zhì)量具有重大的意義。細胞凋亡在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要作用。DS是一種類似于老年性癡呆（Alzheimer diseas

2、e，AD）的神經(jīng)退行性病變，目前細胞凋亡對DS發(fā)生的影響尚未有定論。本研究從蛋白組學入手，篩選DS小鼠海馬差異蛋白的表達，通過差異蛋白的生物信息學分析挑選出關鍵的蛋白分子，從組織學與細胞學角度探討該分子與神經(jīng)元凋亡的關系。本研究將有助于闡明DS神經(jīng)功能缺損的分子機制。
　　目的:
　　（1）以Ts65Dn小鼠作為DS模型，采用iTRAQ技術篩選鑒定其海馬組織中的差異蛋白表達，為深入研究DS神經(jīng)缺陷的分子機制奠定基礎；

3、　?。?）運用生物學信息學分析，明確差異蛋白的性狀及其相互作用，揭示差異蛋白與DS神經(jīng)缺陷發(fā)生發(fā)展的關聯(lián)性；
　?。?）明確DS海馬神經(jīng)元的凋亡狀態(tài)，初步證實Akt蛋白異常表達與DS神經(jīng)細胞凋亡的關系，進一步驗證蛋白組學結果。
　　方法:
　?。?）Ts65Dn小鼠傳代繁殖：用Ts65Dn小鼠作為DS模型，雌雄合籠繁殖子代，以第一代小鼠（16~18周）作為本研究對象。按照Jackson Laboratory推薦采用分子

4、生物學方法檢測小鼠17號染色體GRCm38.p1突變進行子鼠品系的鑒定。
　?。?）應用iTRAQ技術篩選DS小鼠海馬組織的差異蛋白：收集小鼠海馬組織，采用蛋白電泳、蛋白質(zhì)譜的方法進行預實驗，證實樣本蛋白含量符合要求。在此基礎上采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行蛋白電泳，之后進行酶解和肽段定量；采用iTRAQ4標試劑盒進行肽段標記；經(jīng)毛細管高效液相色譜分離后進行質(zhì)譜分析；采用Mascot2.2軟件進行數(shù)據(jù)庫檢索及鑒定，采用Proteome

5、 Discoverer1.3軟件對肽段報告離子峰強度值進行定量分析。
　?。?）差異蛋白的生物信息學分析：針對iTRAQ技術在Ts65Dn小鼠海馬組織中篩選鑒定到的374個差異蛋白，分別采用 GO功能分析和富集分析、KEGG通路分析、Network網(wǎng)絡分析、Hub蛋白分析等方法，闡明差異蛋白的理化特性和生物信息學特征。
　?。?）Akt蛋白在Ts65Dn小鼠神經(jīng)元凋亡中的作用研究：收集海馬組織，采用透射電鏡直接觀察Ts65D

6、n小鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡的形態(tài)學改變；采用TUNEL方法觀察Ts65Dn小鼠海馬神經(jīng)元的凋亡比率；分別采用免疫組化技術與Western blot技術觀察Ts65Dn小鼠海馬組織Akt蛋白及其磷酸化（p-Akt）的表達；從新生Ts65Dn小鼠腦組織分離培養(yǎng)神經(jīng)干細胞，進一步誘導分化為神經(jīng)元細胞；采用LY294002抑制Akt蛋白磷酸活化，阻斷PI3K/Akt通路，采用流式細胞術檢測神經(jīng)細胞凋亡的情況，初步證實Akt蛋白的異常表達與Ts65

7、Dn小鼠神經(jīng)細胞凋亡的關系。
　　結果:
　　（1）Ts65Dn母鼠交配繁殖后，第一代子鼠存活17只，按照Jackson Laboratory推薦的基因型鑒定方法進行型別鑒定。采用iTRAQ技術，經(jīng)Mascot查庫和Proteome Discoverer定量分析，Ts65Dn小鼠海馬組織中共篩選鑒定到2805種蛋白質(zhì)。通過與正常小鼠比較進行顯著性分析并計算其顯著性指數(shù)，共鑒定到顯著性表達差異的蛋白共374個，其中顯著升高的蛋

8、白有195個，表達顯著降低的有179個。
　　（2）利用生物信息學方法對差異蛋白進分析。其中GO分析發(fā)現(xiàn)：分子功能類別以結合蛋白（334，89.3％）、催化活性的蛋白質(zhì)（102，27.3％）和轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)（39，10.4％）數(shù)量最多；生物學途徑以細胞途徑（238，63.6％）、生物調(diào)節(jié)途徑（149，39.8％）和代謝途徑（148，39.6%）為主；細胞學組件大多數(shù)是細胞質(zhì)、胞外區(qū)、細胞膜成分。KEGG分析Ts65Dn小鼠海馬中37

9、4個差異蛋白共有143個蛋白質(zhì)對應到144個不同的KEGG通路，經(jīng)FDR矯正取P<0.05統(tǒng)計分析，Akt蛋白所在通路顯著性富集。
　?。?）Ts65Dn小鼠海馬組織神經(jīng)元出現(xiàn)不同程度的凋亡改變。透射電鏡發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元出現(xiàn)凋亡改變，核膜變薄并輕度下陷、染色體分布不均、核呈固縮性改變、細胞壁凹陷等。TUNEL結果顯示Ts65Dn小鼠海馬組織神經(jīng)元凋亡的陽性表現(xiàn)為細胞漿、細胞核呈棕黃色，與正常小鼠相比，神經(jīng)元凋亡率顯著增加。
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10、4）免疫組化與Western blot結果發(fā)現(xiàn)：Ts65Dn與正常小鼠中樞神經(jīng)組織錐體細胞均有Akt蛋白的表達，與正常小鼠相比，Ts65Dn小鼠中Akt蛋白顯著增高，p-Akt蛋白的表達也顯著增強。從新生Ts65Dn小鼠腦組織成功分離培養(yǎng)出神經(jīng)干細胞，進一步誘導分化為神經(jīng)元，加入LY294002抑制劑培養(yǎng)48h后，Akt磷酸活化被抑制，p-Akt蛋白表達明顯降低，神經(jīng)元凋亡率有降低的趨勢。
　　結論:
　　（1）采用蛋白組學