熱休克蛋白90及其亞型在急性白血病患者及細胞株中的表達及其意義.pdf

1、背景和目的
　　急性白血病是最常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤之一，其發(fā)病是由于骨髓中造血干細胞惡性克隆性增生，從而使正常造血受到抑制。目前，臨床上的化療和/或異基因造血干細胞移植可治愈部分患者，但仍有相當(dāng)部分的患者出現(xiàn)難治及復(fù)發(fā)的情況。這與白血病的多藥耐藥有很大關(guān)聯(lián)，尋找新的治療靶點及闡明白血病耐藥的機制是當(dāng)前研究的重要課題。同時，異基因造血干細胞移植后并發(fā)的移植物抗宿主病是影響患者生存質(zhì)量的重要因素之一，一定程度上限制了其在臨床的廣泛應(yīng)

2、用，探索移植物抗宿主病發(fā)生的相關(guān)因素也是目前的研究熱點之一。
　　熱休克蛋白90(Hsp90)廣泛存在于多種細胞，在多種惡性腫瘤中高表達，很可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。同時還發(fā)現(xiàn)Hsp90參與機體的免疫調(diào)節(jié)及抗原的遞呈過程。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，Hsp90的亞型Hsp90α在急性白血病患者中表達增高，而T細胞激活后其亞型Hsp90β表達明顯上調(diào)，且與p-糖蛋白相關(guān)，這提示我們，Hsp90α可能參與急性白血病的發(fā)生發(fā)展，而Hsp90β可能參與移

3、植物抗宿主病的發(fā)生，以及難治和復(fù)發(fā)急性白血病的耐藥過程。
　　本研究旨在研究熱休克蛋白90(Hsp90)及其亞型(Hsp90α及β)在治療各階段急性白血病患者的骨髓單個核細胞及白血病細胞株中的表達情況，分析其表達差異，觀察臨床轉(zhuǎn)歸與Hsp90、Hsp90α及β表達的聯(lián)系。通過Hsp90抑制17-二甲基胺乙基-17-去甲氧基格爾德霉素(17-DMAG)作用于白血病細胞株，觀察Hsp90在白血病細胞增殖與凋亡中的作用。通過細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)

4、觀察Hsp90α及β在白血病細胞增殖與凋亡中的作用，以及17-DMAG對Hsp90α及β表達的影響。
　　材料和方法:
　　第一部分:①收集白血病細胞株的細胞并提取治療各階段急性白血病患者的骨髓單個核細胞及血清，通過半定量PCR技術(shù)檢測Hsp90在細胞株及骨髓單個核細胞中的基因的表達水平，通過ELISA技術(shù)檢測Hsp90在血清中的蛋白表達水平。②通過臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計，觀察急性白血病患者臨床轉(zhuǎn)歸與Hsp90基因和蛋白表達的聯(lián)系。③

5、收集Jurkat及K562細胞，應(yīng)用Hsp90抑制劑17-DMAG作用于兩種細胞株，通過半定量PCR檢測Hsp90的基因表達，WST技術(shù)檢測17-DMAG對細胞增殖的影響，AnnexinV流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。
　　第二部分:①收集白血病細胞株的細胞并提取治療各階段急性白血病患者的骨髓單個核細胞及血清，通過熒光定量PCR及Westernblotting技術(shù)檢測Hsp90α在細胞株及骨髓單個核細胞中的基因和蛋白的表達水平，通過EL

6、ISA技術(shù)檢測Hsp90α在血清中的蛋白表達水平。②通過臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計，觀察急性白血病患者臨床轉(zhuǎn)歸與Hsp90α基因和蛋白表達的聯(lián)系。③收集Jurkat及K562細胞，利用Hsp90α干擾質(zhì)粒，通過脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染兩種細胞株，通過熒光定量PCR檢測Hsp90α的基因表達，Westernblotting檢測Hsp90α的蛋白表達，WST技術(shù)檢測干擾對細胞增殖的影響，AnnexinV流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。④收集Jurkat及K562細

7、胞，應(yīng)用Hsp90抑制劑17-DMAG作用于兩種細胞株，通過熒光定量PCR及Westernblotting檢測Hsp90α的基因和蛋白表達。
　　第三部分:①收集白血病細胞株的細胞并提取治療各階段急性白血病患者的骨髓單個核細胞及血清，通過熒光定量PCR及Westernblotting技術(shù)檢測Hsp90β在細胞株及骨髓單個核細胞中的基因和蛋白的表達水平，通過ELISA技術(shù)檢測Hsp90β在血清中的蛋白表達水平。②通過臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計，觀

8、察急性白血病患者臨床轉(zhuǎn)歸與Hsp90β基因和蛋白表達的聯(lián)系。③收集Jurkat及K562細胞，應(yīng)用RNA干擾技術(shù)，利用Hsp90β干擾片段，通過脂質(zhì)體2000作用于兩種細胞株，通過熒光定量PCR檢測Hsp90β的基因表達，Westernblotting檢測Hsp90β的蛋白表達，WST技術(shù)檢測干擾對細胞增殖的影響，Annexin(V)流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡情況。④收集Jurkat及K562細胞，應(yīng)用Hsp90抑制劑17-DMAG作用于兩

9、種細胞株，通過熒光定量PCR及Westernblotting檢測Hsp90β的基因和蛋白表達。
　　結(jié)果:
　　第一部分
　　1Hsp90表達情況檢測
　　基因和蛋白檢測表明，與健康對照組患者相比，所有受檢細胞株中Hsp90表達明顯增高，同樣，初治及異基因造血干細胞移植后患者的表達量也明顯增高，尤其是難治及復(fù)發(fā)患者，其Hsp90表達量最高。初治AML及ALL患者的表達無明顯差異。同時，發(fā)生移植物抗宿主反應(yīng)(GVH

10、D)的移植后患者較未發(fā)生GVHD的患者Hsp90表達明顯增高。
　　2Hsp90相關(guān)臨床觀察
　　初治急性白血病患者中，高表達Hsp90的患者完全緩解率更低，隨著初治AL的緩解，Hsp90的表達下降，但疾病復(fù)發(fā)前其Hsp90表達再次增高，且高于初治時水平。
　　317-DMAG處理白血病細胞
　　17-DMAG作用于Jurkat及K562的細胞后，Hsp90基因表達減少，細胞增殖受抑，且促進Jurkat及K562

11、細胞的凋亡。
　　第二部分
　　1.Hsp90α表達情況檢測
　　與健康對照組患者相比，初治急性白血病患者的Hsp90α基因和蛋白表達增高，緩解期患者的表達水平與初治患者相似，難治及復(fù)發(fā)患者和所有受檢細胞株中Hsp90α表達更高。初治AML及ALL患者的表達無明顯差異，健康人與異基因造血干細胞移植后患者的Hsp90α表達量也無明顯差異。
　　2.Hsp90α相關(guān)臨床觀察
　　初治急性白血病患者中，高表達Hs

12、p90α的患者完全緩解率更低，隨著初治AL的緩解，Hsp90α的表達下降，移植后達到最低，但疾病復(fù)發(fā)前其Hsp90α表達再次增高，且高于初治時水平。
　　3.Hsp90α轉(zhuǎn)染白血病細胞
　　Hsp90α質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Jurkat及K562的細胞后，Hsp90α基因和蛋白表達減少，細胞增殖受抑，且促進Jurkat及K562細胞的凋亡。
　　4.17-DMAG處理白血病細胞
　　17-DMAG作用于Jurkat及K562的

13、細胞后，Hsp90α基因及蛋白表達減少。
　　第三部分
　　1.Hsp90β表達情況檢測
　　PCR和Westernblotting檢測結(jié)果表明，與健康對照組患者相比，所有受檢細胞株中Hsp90β基因和蛋白表達明顯增高，初治及緩解期患者的表達量也明顯增高，尤其是難治及復(fù)發(fā)患者，其Hsp90β表達量最高。發(fā)生移植物抗宿主反應(yīng)(GVHD)的移植后患者較未發(fā)生GVHD的患者Hsp90β表達明顯增高。初治AML及ALL患者的表

14、達無明顯差異。
　　2.Hsp90β相關(guān)臨床觀察
　　高表達Hsp90β的初治急性白血病患者有較低的完全緩解率，隨著初治AL的緩解，Hsp90β的表達下降，但疾病復(fù)發(fā)前其Hsp90β表達再次增高，且高于初治時水平。但是ELISA的結(jié)果完全不同，每組患者的Hsp90β蛋白表達均極少，所有分組之間無明顯差別。
　　3.Hsp90β轉(zhuǎn)染白血病細胞
　　Hsp90β干擾片段轉(zhuǎn)染Jurkat及K562的細胞后，Hsp90β

15、基因和蛋白表達減少（P＜0.05），可抑制細胞增殖，但這種抑制細胞增殖的作用較弱，且不能明顯促進Jurkat及K562細胞的凋亡。
　　4.17-DMAG處理白血病細胞
　　17-DMAG作用于Jurkat及K562的細胞后，Hsp90β基因及蛋白表達減少(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.Hsp90可能在急性白血病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，且可以作為預(yù)測臨床預(yù)后的一個指標。Hsp90抑制劑17-DMAG能夠

16、抑制白血病細胞株Jurkat及K562細胞的增殖，誘導(dǎo)Jurkat和K562細胞凋亡。該研究為17-DMAG應(yīng)用臨床治療急性白血病提供了理論基礎(chǔ)。
　　2.Hsp90α可能在急性白血病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，且可以作為預(yù)測臨床預(yù)后的一個指標。Hsp90α選擇性抑制劑可作為針對急性白血病患者的一種新的靶向治療方法，17-DMAG可抑制Hsp90α基因及蛋白的表達。
　　3.Hsp90β與GVHD的發(fā)生有關(guān)，可用于移植后預(yù)測G