mTOR在白血病及白血病細胞株中的表達及意義.pdf

1、目的：研究白血病細胞中哺乳類雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)表達情況；研究雷帕霉素對白血病細胞的增殖抑制作用以及其對細胞周期的影響；分析該藥作用前后mTOR mRNA表達水平的改變。 方法：1.采用實時熒光定量PCR檢測白血病患者及白血病細胞株的mTOR mRSA表達情況。2.采用四唑氮藍比色試驗(MTT)觀察雷帕霉素對白血病細胞株KGL1，K562和U937的體外增殖抑制作

2、用。3.應用流式細胞術(shù)(FCM)檢測雷帕霉素干預后的白血病細胞株的細胞周期的阻滯情況。 結(jié)果： 1.各組中mTOR mRNA表達情況1.1 mTOR mRNA在急性白血病中表達情況新近診斷急性白血病(AL)患者組.mTOR mRNA表達水平明顯高于正常對照組(P＜0.05)。復發(fā)組mTOR mRNA表達水平高于正常對照組(P＜0.05)，高于AL組，但與AL組差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。持續(xù)完全緩解組(CCR)mT

3、OR。mRNA表達水平低于AL組及復發(fā)組(P值均小于0.05)，比正常對照組高，但無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。 mTOR mRNA在AML組M2、M3、M4、M5、M6各亞型間表達水平有差別，但各亞型間差別無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 1.2 mTOR mRNA在慢性粒細胞白血病慢性期中表達情況慢性粒細胞白血病慢性期(CP)患者組mTOR mRNA表達水平明顯高于正常對照(NC)組(P＜0.05)，低于新近診斷急性白

4、血病組及復發(fā)組，差別有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 2.急性白血病(AL)患者mTOR mRNA表達情況與臨床療效的關(guān)系43例新近診斷AL患者中40例可進行療效評估(1例早期死亡，2例未治療)。 33例獲得完全緩解(CR)，CR率83.3％(33/40)，完全緩解組患者mTOR mRNA表達水平較治療前mTOR mRNA表達水平明顯降低，亦低于復發(fā)組，差別有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)；高于正常對照組和CCR組，差別無統(tǒng)計

5、學意義(p＞0.05)。7例未完全緩解患者表達水平與治療前mTOR mRNA表達水平有所升高，低于復發(fā)組患者，但與兩組相比均無統(tǒng)計學意義(p＞0.05)；與緩解組和正常對照組相比差異顯著(p＜0.05)。 3.不同濃度雷帕霉素對白血病細胞株KG1、K562和U937的增殖抑制情況雷帕霉素作用濃度分別為1 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、500 nmol/L3.1雷帕

6、霉素對KGl細胞株24h的增殖抑制率分別為31％、42％、70％、73％、78％、81％；且呈劑量依賴性。1 nmol/L、10 nmol/L與20 nmol/L組間有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。隨著雷帕霉素濃度的增大，抑制率亦在增加，但是與20 nmol/L組比較沒有明顯差異(P＞0.05)。 3.2雷帕霉素對K562細胞24小時的抑制率分別為9％、13％、18％、20％、21％、27％，隨著劑量的增加抑制率增加，1 nmol

7、/L與50 nmol/L、100 nmol/L、500 nmol/L三組間均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，10 nmol/L、20nmol/L與500 nmol/L差異顯著(P＜0.05)。其余各組之間沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 3.3雷帕霉素對U937細胞24小時的抑制率為4％、6％、1 0％、12％、21％、26％，1 nmol/L與1 00 nmol/L、500 nmol/L兩組間均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，10 nmo

8、l/L、20nmol/L與500 nmogL差異顯著(P＜0.05)。其余各組之間沒有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 4 雷帕霉素誘導KG1、K562和U937細胞株的凋亡情況雷帕霉素作用前細胞胞膜完整無破損，胞漿透明無顆粒。雷帕霉素不同濃度分別作用KG1、K562和U937細胞24h后，可見到典型的細胞凋亡形態(tài)學改變，表現(xiàn)為細胞折光性減低，細胞體積變小、變形；隨著藥物作用時間延長，凋亡細胞的數(shù)量增加；藥物作用到48小時后，折光性

9、進一步減低，并且出現(xiàn)細胞裂解碎片，以KG1細胞株最明顯。 5 不同濃度雷帕霉素作用于KG1、K562和U937細胞株后細胞周期的變化分別采用雷帕霉素0nmol/L 1 nmol/L、20nmol/L、100 nmol/L作用于白血病細胞株KG1、K562和U937 24h。KG1細胞G0/G1期細胞比例分別為50.88％、68.32％、83.54％、85.31％；K562細胞中G0/G1期細胞比例分別為41.13％、42.96％

10、、54.05％、56.63％； U937細胞周期中G0/G1期細胞比例分別為38.17％、48.37％、50.54％、54.63％，與不加藥的對照組相比， G0/G1期細胞比例均增加。 6 雷帕霉素作用于KG1、K562和U937細胞株后mTORmRNA表達水平應用0noml/L、1 nmol/L、20 nmol/L、100 nmol/L 的雷帕霉素作用KG1、K562和U937細胞株24小時。KG1細胞中mTOR mRNA表達

11、水平隨著濃度的增加逐漸下降，20 nmol/L與100 nmol/L差別沒有統(tǒng)計學意義(p＞0.05)，其余各濃度之間差別顯著(p＜0.05)。K562和U937細胞中mTOR mRNA表達水平隨著雷帕霉素濃度的增加而下降，但1 nmol/L濃度組與對照組無明顯差異(p＞0.05)，其余各濃度之間差別顯著(p＜0.05)。 結(jié)論： 1.新近診斷AL組患者中mTOR mRNA表達水平明顯高于正常對照組中mTOR mRNA表

12、達水平。復發(fā)組患者mTORmRNA表達水平明顯高于NC組，CCR組患者中mTORmRNA水平明顯低于AL組及復發(fā)組，而與正常對照組無明顯差別。 2.完全緩解組患者mTOR mRNA表達水平較治療前mTORmRNA表達水平明顯降低，亦低于復發(fā)組，差別有統(tǒng)計學意義；高于正常對照組和CCR組，差別無統(tǒng)計學意義。7例未完全緩解患者表達水平與治療前mTOR mRNA表達水平有所升高，低于復發(fā)組患者，但與兩組相比均無統(tǒng)計學意義；與緩解組和正

13、常對照組相比差異顯著。 3.在慢性粒細胞白血病患者中，mTOR mRNA表達水平明顯高于正常對照組，低于新近診斷白血病組和復發(fā)組mTORmRNA表達水平，差別顯著。 4 不同濃度的雷帕霉素作用于KGl細胞株，20nmol為最佳有效濃度，細胞可以被明顯的抑制，細胞周期可以明顯阻滯在G0/G1期，而且細胞凋亡明顯，mTOR mRNA的表達水平亦顯著降低。 5 不同濃度的雷帕霉素作用于K562和U937細胞株，隨著雷帕霉素濃度