mTOR在白血病及白血病細(xì)胞株中的表達(dá)及意義.pdf

1、目的：研究白血病細(xì)胞中哺乳類雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)表達(dá)情況；研究雷帕霉素對白血病細(xì)胞的增殖抑制作用以及其對細(xì)胞周期的影響；分析該藥作用前后mTOR mRNA表達(dá)水平的改變。 方法：1.采用實時熒光定量PCR檢測白血病患者及白血病細(xì)胞株的mTOR mRSA表達(dá)情況。2.采用四唑氮藍(lán)比色試驗(MTT)觀察雷帕霉素對白血病細(xì)胞株KGL1，K562和U937的體外增殖抑制作

2、用。3.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測雷帕霉素干預(yù)后的白血病細(xì)胞株的細(xì)胞周期的阻滯情況。 結(jié)果： 1.各組中mTOR mRNA表達(dá)情況1.1 mTOR mRNA在急性白血病中表達(dá)情況新近診斷急性白血病(AL)患者組.mTOR mRNA表達(dá)水平明顯高于正常對照組(P＜0.05)。復(fù)發(fā)組mTOR mRNA表達(dá)水平高于正常對照組(P＜0.05)，高于AL組，但與AL組差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。持續(xù)完全緩解組(CCR)mT

3、OR。mRNA表達(dá)水平低于AL組及復(fù)發(fā)組(P值均小于0.05)，比正常對照組高，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。 mTOR mRNA在AML組M2、M3、M4、M5、M6各亞型間表達(dá)水平有差別，但各亞型間差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 1.2 mTOR mRNA在慢性粒細(xì)胞白血病慢性期中表達(dá)情況慢性粒細(xì)胞白血病慢性期(CP)患者組mTOR mRNA表達(dá)水平明顯高于正常對照(NC)組(P＜0.05)，低于新近診斷急性白

4、血病組及復(fù)發(fā)組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。 2.急性白血病(AL)患者mTOR mRNA表達(dá)情況與臨床療效的關(guān)系43例新近診斷AL患者中40例可進(jìn)行療效評估(1例早期死亡，2例未治療)。 33例獲得完全緩解(CR)，CR率83.3％(33/40)，完全緩解組患者mTOR mRNA表達(dá)水平較治療前mTOR mRNA表達(dá)水平明顯降低，亦低于復(fù)發(fā)組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義(p＜0.05)；高于正常對照組和CCR組，差別無統(tǒng)計

5、學(xué)意義(p＞0.05)。7例未完全緩解患者表達(dá)水平與治療前mTOR mRNA表達(dá)水平有所升高，低于復(fù)發(fā)組患者，但與兩組相比均無統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)；與緩解組和正常對照組相比差異顯著(p＜0.05)。 3.不同濃度雷帕霉素對白血病細(xì)胞株KG1、K562和U937的增殖抑制情況雷帕霉素作用濃度分別為1 nmol/L、10 nmol/L、20 nmol/L、50 nmol/L、100 nmol/L、500 nmol/L3.1雷帕

6、霉素對KGl細(xì)胞株24h的增殖抑制率分別為31％、42％、70％、73％、78％、81％；且呈劑量依賴性。1 nmol/L、10 nmol/L與20 nmol/L組間有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。隨著雷帕霉素濃度的增大，抑制率亦在增加，但是與20 nmol/L組比較沒有明顯差異(P＞0.05)。 3.2雷帕霉素對K562細(xì)胞24小時的抑制率分別為9％、13％、18％、20％、21％、27％，隨著劑量的增加抑制率增加，1 nmol

7、/L與50 nmol/L、100 nmol/L、500 nmol/L三組間均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，10 nmol/L、20nmol/L與500 nmol/L差異顯著(P＜0.05)。其余各組之間沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 3.3雷帕霉素對U937細(xì)胞24小時的抑制率為4％、6％、1 0％、12％、21％、26％，1 nmol/L與1 00 nmol/L、500 nmol/L兩組間均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，10 nmo

8、l/L、20nmol/L與500 nmogL差異顯著(P＜0.05)。其余各組之間沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。 4 雷帕霉素誘導(dǎo)KG1、K562和U937細(xì)胞株的凋亡情況雷帕霉素作用前細(xì)胞胞膜完整無破損，胞漿透明無顆粒。雷帕霉素不同濃度分別作用KG1、K562和U937細(xì)胞24h后，可見到典型的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)改變，表現(xiàn)為細(xì)胞折光性減低，細(xì)胞體積變小、變形；隨著藥物作用時間延長，凋亡細(xì)胞的數(shù)量增加；藥物作用到48小時后，折光性

9、進(jìn)一步減低，并且出現(xiàn)細(xì)胞裂解碎片，以KG1細(xì)胞株最明顯。 5 不同濃度雷帕霉素作用于KG1、K562和U937細(xì)胞株后細(xì)胞周期的變化分別采用雷帕霉素0nmol/L 1 nmol/L、20nmol/L、100 nmol/L作用于白血病細(xì)胞株KG1、K562和U937 24h。KG1細(xì)胞G0/G1期細(xì)胞比例分別為50.88％、68.32％、83.54％、85.31％；K562細(xì)胞中G0/G1期細(xì)胞比例分別為41.13％、42.96％

10、、54.05％、56.63％； U937細(xì)胞周期中G0/G1期細(xì)胞比例分別為38.17％、48.37％、50.54％、54.63％，與不加藥的對照組相比， G0/G1期細(xì)胞比例均增加。 6 雷帕霉素作用于KG1、K562和U937細(xì)胞株后mTORmRNA表達(dá)水平應(yīng)用0noml/L、1 nmol/L、20 nmol/L、100 nmol/L 的雷帕霉素作用KG1、K562和U937細(xì)胞株24小時。KG1細(xì)胞中mTOR mRNA表達(dá)

11、水平隨著濃度的增加逐漸下降，20 nmol/L與100 nmol/L差別沒有統(tǒng)計學(xué)意義(p＞0.05)，其余各濃度之間差別顯著(p＜0.05)。K562和U937細(xì)胞中mTOR mRNA表達(dá)水平隨著雷帕霉素濃度的增加而下降，但1 nmol/L濃度組與對照組無明顯差異(p＞0.05)，其余各濃度之間差別顯著(p＜0.05)。 結(jié)論： 1.新近診斷AL組患者中mTOR mRNA表達(dá)水平明顯高于正常對照組中mTOR mRNA表

12、達(dá)水平。復(fù)發(fā)組患者mTORmRNA表達(dá)水平明顯高于NC組，CCR組患者中mTORmRNA水平明顯低于AL組及復(fù)發(fā)組，而與正常對照組無明顯差別。 2.完全緩解組患者mTOR mRNA表達(dá)水平較治療前mTORmRNA表達(dá)水平明顯降低，亦低于復(fù)發(fā)組，差別有統(tǒng)計學(xué)意義；高于正常對照組和CCR組，差別無統(tǒng)計學(xué)意義。7例未完全緩解患者表達(dá)水平與治療前mTOR mRNA表達(dá)水平有所升高，低于復(fù)發(fā)組患者，但與兩組相比均無統(tǒng)計學(xué)意義；與緩解組和正

13、常對照組相比差異顯著。 3.在慢性粒細(xì)胞白血病患者中，mTOR mRNA表達(dá)水平明顯高于正常對照組，低于新近診斷白血病組和復(fù)發(fā)組mTORmRNA表達(dá)水平，差別顯著。 4 不同濃度的雷帕霉素作用于KGl細(xì)胞株，20nmol為最佳有效濃度，細(xì)胞可以被明顯的抑制，細(xì)胞周期可以明顯阻滯在G0/G1期，而且細(xì)胞凋亡明顯，mTOR mRNA的表達(dá)水平亦顯著降低。 5 不同濃度的雷帕霉素作用于K562和U937細(xì)胞株，隨著雷帕霉素濃度