肝癌細胞膜蛋白單克隆抗體的篩選與制備.pdf

1、目的：提取肝癌細胞膜蛋白作為抗原，利用雜交瘤抗體技術(shù)篩選并制備針對肝癌細胞膜蛋白的單克隆抗體。 方法：分別利用研磨方法（第一部分）、膜蛋白提取試劑盒（第二部分）、低滲法（第三部分）提取肝癌細胞HepG2細胞膜蛋白作為抗原，超速離心法純化抗原。純化后Bradford法進行蛋白定量。用提取的抗原每次25ug-50ug劑量免疫Balb/c小鼠；以聚乙二醇法融合免疫小鼠脾細胞與SP20骨髓瘤細胞，用HAT、HT選擇培養(yǎng)基篩選雜交瘤；以提

2、取的肝癌細胞膜蛋白作為包被抗原，用ELISA方法篩選能分泌抗肝癌細胞膜蛋白單克隆抗體的陽性雜交瘤細胞克??；擴大培養(yǎng)所獲得的單克隆細胞，制備單克隆抗體，檢測所獲得單克隆抗體與肝癌細胞膜蛋白的反應(yīng)性。 結(jié)果：研磨方法提取膜蛋白，免疫四次后，ELISA檢測免疫小鼠血清抗體效價達1：105，尾靜脈沖擊免疫后進行細胞融合，融合四周后，共有10株陽性克隆細胞，擴大培養(yǎng)后共有5株克隆生長，但ELISA檢測均為陰性；膜蛋白提取試劑盒提取膜蛋白，

3、50ug劑量免疫小鼠共四次后，ELISA檢測免疫小鼠血清抗體效價均為陰性，用真空干燥法去除有機溶劑后再次免疫小鼠，小鼠血清抗體效價仍為陰性，免疫失??；低滲法提取膜蛋白，免疫小鼠五次后，ELISA檢測免疫小鼠血清抗體效價達1：106，細胞融合后四周，共有22株陽性克隆細胞，擴大培養(yǎng)后共有15株克隆生長，但多次ELISA檢測細胞培養(yǎng)上清均為陰性。 結(jié)論：用研磨方法及低滲法提取肝癌細胞膜蛋白作為抗原，制備針對肝癌細胞膜蛋白的單克隆抗體

4、存在一定缺陷。這兩種方法所提取的膜蛋白純度不高、獲得的膜蛋白量小，細胞膜蛋白抗原成分多，用所提取的膜蛋白制備單克隆抗體相對比較困難。本實驗?zāi)康氖轻槍ζ渲懈鞣N單一抗原制備單克隆抗體，故研磨方法中以每次25ug劑量免疫小鼠，劑量顯然不足，故在試劑盒方法及低滲法提取膜蛋白時增加免疫劑量至5Qug。用所提取的細胞膜蛋白免疫小鼠，血清中產(chǎn)生的是多克隆抗體，針對單一抗原所產(chǎn)生的血清效價低于針對細胞膜蛋白抗原的血清效價，故應(yīng)盡量待血清效價達1：106