肝癌細(xì)胞膜蛋白單克隆抗體的篩選與制備.pdf

1、目的：提取肝癌細(xì)胞膜蛋白作為抗原，利用雜交瘤抗體技術(shù)篩選并制備針對(duì)肝癌細(xì)胞膜蛋白的單克隆抗體。 方法：分別利用研磨方法（第一部分）、膜蛋白提取試劑盒（第二部分）、低滲法（第三部分）提取肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞膜蛋白作為抗原，超速離心法純化抗原。純化后Bradford法進(jìn)行蛋白定量。用提取的抗原每次25ug-50ug劑量免疫Balb/c小鼠；以聚乙二醇法融合免疫小鼠脾細(xì)胞與SP20骨髓瘤細(xì)胞，用HAT、HT選擇培養(yǎng)基篩選雜交瘤；以提

2、取的肝癌細(xì)胞膜蛋白作為包被抗原，用ELISA方法篩選能分泌抗肝癌細(xì)胞膜蛋白單克隆抗體的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞克??；擴(kuò)大培養(yǎng)所獲得的單克隆細(xì)胞，制備單克隆抗體，檢測(cè)所獲得單克隆抗體與肝癌細(xì)胞膜蛋白的反應(yīng)性。 結(jié)果：研磨方法提取膜蛋白，免疫四次后，ELISA檢測(cè)免疫小鼠血清抗體效價(jià)達(dá)1：105，尾靜脈沖擊免疫后進(jìn)行細(xì)胞融合，融合四周后，共有10株陽(yáng)性克隆細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)后共有5株克隆生長(zhǎng)，但ELISA檢測(cè)均為陰性；膜蛋白提取試劑盒提取膜蛋白，

3、50ug劑量免疫小鼠共四次后，ELISA檢測(cè)免疫小鼠血清抗體效價(jià)均為陰性，用真空干燥法去除有機(jī)溶劑后再次免疫小鼠，小鼠血清抗體效價(jià)仍為陰性，免疫失敗；低滲法提取膜蛋白，免疫小鼠五次后，ELISA檢測(cè)免疫小鼠血清抗體效價(jià)達(dá)1：106，細(xì)胞融合后四周，共有22株陽(yáng)性克隆細(xì)胞，擴(kuò)大培養(yǎng)后共有15株克隆生長(zhǎng)，但多次ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清均為陰性。 結(jié)論：用研磨方法及低滲法提取肝癌細(xì)胞膜蛋白作為抗原，制備針對(duì)肝癌細(xì)胞膜蛋白的單克隆抗體

4、存在一定缺陷。這兩種方法所提取的膜蛋白純度不高、獲得的膜蛋白量小，細(xì)胞膜蛋白抗原成分多，用所提取的膜蛋白制備單克隆抗體相對(duì)比較困難。本實(shí)驗(yàn)?zāi)康氖轻槍?duì)其中各種單一抗原制備單克隆抗體，故研磨方法中以每次25ug劑量免疫小鼠，劑量顯然不足，故在試劑盒方法及低滲法提取膜蛋白時(shí)增加免疫劑量至5Qug。用所提取的細(xì)胞膜蛋白免疫小鼠，血清中產(chǎn)生的是多克隆抗體，針對(duì)單一抗原所產(chǎn)生的血清效價(jià)低于針對(duì)細(xì)胞膜蛋白抗原的血清效價(jià)，故應(yīng)盡量待血清效價(jià)達(dá)1：106