對(duì)蝦白斑癥病毒囊膜蛋白單克隆抗體的研制及中和抗體篩選.pdf

1、白斑癥病毒(WSSV)病是危害對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要疾病之一，十余年來(lái)國(guó)內(nèi)外學(xué)者已對(duì)其進(jìn)行了大量研究。由于WSSV的囊膜與靶細(xì)胞相互作用從而介導(dǎo)病毒對(duì)宿主的感染，因此探明這一機(jī)理并進(jìn)而阻斷，成為防控WSSV感染的重要途徑。本文通過(guò)抗WSSV不同囊膜蛋白單克隆抗體的研制，分別獲得了抗VP28，VP26及VP19線性表位的單抗；通過(guò)WSSV囊膜蛋白單克隆抗體對(duì)WSSV的體內(nèi)與體外中和，篩選得到兩株具明顯病毒中和作用的抗VP28單抗；應(yīng)用抗

2、VP28單抗檢測(cè)分析VP28與宿主細(xì)胞的作用關(guān)系，論證了其在WSSV感染中的作用：另外，論文通過(guò)單抗標(biāo)記及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)螯蝦血細(xì)胞內(nèi)的WSSV，分析了機(jī)體感染進(jìn)程中WSSV對(duì)血細(xì)胞的感染規(guī)律。具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： (1)WSSV囊膜蛋白單抗的研制。差速離心和蔗糖密度梯度離心從對(duì)蝦鰓組織中分離獲得WSSV，之后通過(guò)SDS-PAGE、切膠、蛋白洗脫方式分離獲得病毒系列蛋白(VP31、VP28、VP26、VP19、以及VP76和V

3、P51左右蛋白)。以獲得的病毒蛋白為抗原免疫Balb/C小鼠，采用單克隆抗體技術(shù)經(jīng)細(xì)胞融合、篩選、有限稀釋法克隆共獲得3種抗WSSV囊膜蛋白線性表位的單抗，其中抗VP28單抗8株(1D6、2C8、2G3、2H5、3A6、3E1、485、5D2)，抗VP26單抗3株(2D10、3G7、3H9)，抗VP19單抗2株(2C7、2E9)。間接免疫熒光證明各株單抗均與感染W(wǎng)SSV的蝦鰓切片呈特異性反應(yīng)；Western-blot實(shí)驗(yàn)證明上述三組單抗

4、所結(jié)合的抗原決定簇分別位于WSSV的VP28、VP26以及VP19上；抗體的亞型分析測(cè)定結(jié)果表明：?jiǎn)慰筶D6，2G3，2H5，3.A6，3E1，485，5D2，3G7，3H9，2C7和2E9屬IgG亞型：?jiǎn)慰?C8和2D10屬IgM亞型。 (2)單抗對(duì)WSSV的體內(nèi)中和。以克氏原螯蝦(Cambarus proclarkii)動(dòng)物模型檢測(cè)WSSV各囊膜蛋白單抗的中和效果。從自然感染的對(duì)蝦組織中粗提WSSV，將病毒液作一定濃度稀釋后

5、與單抗1:1孵育2h，之后皮下注射克氏原螯蝦(50μl/只)，觀察記錄螯蝦的死亡情況。結(jié)果顯示2株VP28單抗(1D6，2G3)與病毒混合作用后感染的螯蝦組出現(xiàn)死亡的時(shí)間(4d，3d)和達(dá)到100％死亡率的時(shí)間(13d，12d)比對(duì)照組(注射未經(jīng)單抗作用病毒，1d，7d)明顯延遲，其他單抗組與對(duì)照組相近或稍有提前。結(jié)果表明1D6和2G3可明顯延緩WSSV對(duì)宿主的感染，部分中和了WSSV的感染力。 (3)單抗對(duì)WSSV的體外中和。

6、通過(guò)ELISA實(shí)驗(yàn)分析單抗對(duì)WSSV與對(duì)蝦血細(xì)胞膜結(jié)合的阻斷效果驗(yàn)證單抗的中和性。提取中國(guó)對(duì)蝦(Fenneropenaeus chinensis)血細(xì)胞膜并對(duì)WSSV進(jìn)行地高辛(DIG)標(biāo)記，將病毒和各單抗混合作用后吸附對(duì)蝦血細(xì)胞膜，使用抗地高辛抗體檢測(cè)結(jié)合到血細(xì)胞膜上的病毒。結(jié)果顯示單抗1D6，2G3組WSSV的結(jié)合量(OD值：0.207，0.235)明顯低于對(duì)照組(病毒未與單抗作用，OD值：0.401)，其它單抗組與對(duì)照組差異不明顯

7、。結(jié)果表明單抗1D6，2G3可以明顯降低WSSV和血細(xì)胞膜的結(jié)合，通過(guò)阻礙WSSV與宿主細(xì)胞的結(jié)合進(jìn)而延緩病毒感染，兩株單抗均具有部分中和作用。 (4)VP28與靶細(xì)胞作用關(guān)系的分析。中國(guó)對(duì)蝦血細(xì)胞與提純的VP28作用后，應(yīng)用VP28單抗進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果顯示對(duì)蝦血細(xì)胞與VP28作用后細(xì)胞邊緣呈現(xiàn)特異性熒光亮點(diǎn)：中國(guó)對(duì)蝦血細(xì)胞膜與提純的VP28作用后，應(yīng)用VP28單抗進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示呈現(xiàn)陽(yáng)性反應(yīng)；對(duì)蝦血細(xì)胞電泳轉(zhuǎn)

8、移至硝酸纖維素膜，鋪覆VP28作用后，應(yīng)用VP28單抗進(jìn)行免疫印跡試驗(yàn)，結(jié)果顯示VP28與中國(guó)對(duì)蝦血細(xì)胞膜上的72kDa蛋白結(jié)合。以上三項(xiàng)實(shí)驗(yàn)均表明洗脫提純的VP28可與對(duì)蝦血細(xì)胞膜特異性結(jié)合，其通過(guò)與宿主細(xì)胞的黏附作用介導(dǎo)病毒感染，同時(shí)推測(cè)VP28作用的關(guān)鍵位點(diǎn)為線性結(jié)構(gòu)。 (5)WSSV對(duì)克氏原螯蝦血細(xì)胞的感染。通過(guò)皮下注射WSSV感染螯蝦后每24h收集血細(xì)胞，經(jīng)WSSV單抗及熒光二抗染色后應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，同時(shí)記錄累積死

9、亡率及血細(xì)胞密度。結(jié)果顯示感染后1-5天：螯蝦的累積死亡率為3.3，13.3，16.7，36.7，70.0(％)：血細(xì)胞被感染比例為6.47，6.93，10.65，26.08，4.94(％)：被感染細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度為10.7，10.89，11.7l，13.77，15.47：血細(xì)胞密度(×106個(gè)/ml)為7.56±0.30，5.60±0.24，4.2l±0.30，1.45±0.26，1.21±0.21(未感染為5.34±0.22)。以上

10、結(jié)果表明，在機(jī)體感染進(jìn)程中，螯蝦血細(xì)胞密度呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，至后期僅為感染前的1/5；血細(xì)胞被感染率同時(shí)也呈現(xiàn)了先上升后下降的變化趨勢(shì)，但被感染血細(xì)胞中的病毒量則始終呈上升趨勢(shì)；血細(xì)胞處于最高感染率時(shí)機(jī)體瀕臨死亡，表明血細(xì)胞的WSSV感染程度與機(jī)體的感染狀況密切相關(guān)。 綜上，本論文在獲得WSSV多種囊膜蛋白單克隆抗體的基礎(chǔ)上，成功篩選到兩株能夠明顯中和WSSV的單抗，這為進(jìn)一步應(yīng)用中和抗體阻斷WSSV感染提供了工具：同時(shí)，