造血干細(xì)胞向淋巴系祖細(xì)胞增殖分化過(guò)程中同源盒基因表達(dá)的研究.pdf

1、目的：本課題主要探討人類臍血造血干細(xì)胞（Hematopoietic Stem Cell，HSC）向淋巴系祖細(xì)胞（Colony Forming Unit-T Lymphocyte，CFU-TL）增殖分化過(guò)程中HOXC4、HOXC6、HOXB4、HOXB6基因表達(dá)的情況，并且用全反式維甲酸（all-trans-retinoic acid，ATRA）進(jìn)行干擾，以觀察在此過(guò)程中ATRA對(duì)HOX基因表達(dá)的影響。 方法： 1．10例

2、臍血標(biāo)本由本院產(chǎn)房提供，取自正常足月順產(chǎn)新生兒斷臍后的胎盤段臍血。 2．實(shí)驗(yàn)分組。實(shí)驗(yàn)分2組：（1）正常組（normal）：不加全反式維甲酸，代之等量1640培養(yǎng)液加入基本培養(yǎng)體系。（2）維甲酸組（all-trans-retinoic acid，ATRA組）：加入ATRA稀釋液0．1ml，終濃度6×10-8mol/l。 3．采用造血干/祖細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)，以ATRA持續(xù)干擾人類造血干細(xì)胞，觀察正常組、維甲酸組的人類臍血H

3、SC經(jīng)植物血凝素（Phytohemagglutinin，PHA-M）誘導(dǎo)后，在培養(yǎng)過(guò)程第3天，7天和12天的CFU-TL集落生成情況。 4．采用瑞氏染色法鑒定CFU-TL集落細(xì)胞成分。 5．在第3天、第7天、第12天分別提取各組細(xì)胞總RNA，用1%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA分子的完整性。 6．通過(guò)隨機(jī)引物將各時(shí)間點(diǎn)提取到的兩組細(xì)胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Fluorescen

4、ce Quantitative Real Time Polymerize Chain Reaction，F(xiàn)Q-RT-PCR）進(jìn)行擴(kuò)增并檢測(cè)臍血造血干細(xì)胞向淋巴系祖細(xì)胞增殖分化過(guò)程中兩組HOXC4、HOXC6、HOXB4、HOXB6基因的表達(dá)水平。 7．隨機(jī)抽取HOXC4、HOXC6、HOXB4、HOXB6基因通過(guò)電泳實(shí)驗(yàn)分別獲得其在3天、7天、12天電泳圖。 8．統(tǒng)計(jì)方法：結(jié)果用DNA相對(duì)拷貝數(shù)和RNA表達(dá)相對(duì)量（2-△

5、△Ct）表示HOX4、HOXC6、HOXB4、HOXB6基因相對(duì)表達(dá)量，采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示HOXC4、HOXC6、HOXB4、HOXB6基因的變化情況。進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，ONE-WAY方差分析，組間均數(shù)兩兩比較用LSD法。兩組間基因相對(duì)表達(dá)量比較采用配對(duì)設(shè)計(jì)t檢驗(yàn)。由統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS15．0完成。 結(jié)果： 1．集落細(xì)胞的形態(tài)學(xué)鑒定，瑞．氏染色法證明所培養(yǎng)的是淋巴系細(xì)胞。 2．1%甲醛變性瓊脂糖凝膠

6、電泳顯示RNA電泳圖的5s，18s，28s三條帶型整齊，無(wú)明顯拖尾及彌散，說(shuō)明RNA結(jié)構(gòu)完整，無(wú)明顯降解。 3．逆轉(zhuǎn)錄PCR擴(kuò)增目的基因HOXC4、HOXC6、HOXB4、HOXB6和內(nèi)參照GAPDH基因的cDNA的產(chǎn)物，與DNA分子Marker相比示擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為：HOXC4為254個(gè)堿基（bp），HOXC6212bp，HOXB4138bp，HOXB6119bp，GAPDH基因?yàn)?41bp，與預(yù)定理論值大小符合。

7、4．人臍血造血干細(xì)胞向淋巴系祖細(xì)胞增殖分化過(guò)程中，兩組細(xì)胞的HOX基因均有規(guī)律的表達(dá)，隨培養(yǎng)時(shí)間推移，正常組、ATRA組HOXC4、HOXC6，HOXB6基因均在增殖分化的第7天表達(dá)最強(qiáng)烈，第12天表達(dá)明顯降低，而HOXB4基因表達(dá)卻隨培養(yǎng)時(shí)間推移逐漸降低。 5．與正常組比較，HOXC4、HOXC6、 HOXB4、HOXB6基因均受ATRA（6×10-8mol/l）的上調(diào)。 結(jié)論： 1．HOXC4、HOXC6、H