神經(jīng)干細(xì)胞在其分化過程中bHLH基因的表達(dá)變化.pdf

1、神經(jīng)干細(xì)胞因其具有自我更新能力和多向分化潛能，已成為當(dāng)前神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。但對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞的研究仍處于探索階段，其培養(yǎng)和定向分化仍有一定的難度。神經(jīng)干細(xì)胞可從動(dòng)物（包括人）胚胎及其成體腦等獲得，并且在絲裂原的存在下，可以在體外長(zhǎng)期保持自我更新及多向分化潛能。 神經(jīng)干細(xì)胞的存活需要葡萄糖的存在，其缺乏可導(dǎo)致細(xì)胞功能的喪失，甚至死亡，葡萄糖是神經(jīng)干細(xì)胞體外培養(yǎng)的基本條件之一。 對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)是研究其增殖、分化機(jī)

2、制的先決條件，而對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化機(jī)制的深入理解則是其臨床應(yīng)用的關(guān)鍵。目前廣泛認(rèn)為神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化主要受微環(huán)境和基因調(diào)控。 bHLH 基因家族是一類轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子家族，既往研究發(fā)現(xiàn)該家族在很多組織及細(xì)胞的發(fā)育、增殖、分化等過程中起重要作用，尤其是中樞神經(jīng)組織表現(xiàn)特別明顯。bHLH 基因分為抑制型（如Hes 家族）和激活型（如mash1 和math 家族），兩者處于動(dòng)態(tài)平衡，共同調(diào)控NSCs 的分化并且決定著其分化方向。本實(shí)驗(yàn)分

3、別通過以下實(shí)驗(yàn)對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞原代培養(yǎng)和增殖分化機(jī)制進(jìn)行探討。 第一部分小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)及葡萄糖對(duì)其增殖分化的影響 1、小鼠神經(jīng)干細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定 取孕13d 的昆明小鼠胎腦，分離后用含有表皮生長(zhǎng)因子和堿性成纖維生長(zhǎng)因子的無血清條件培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，定期傳代。隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞逐漸增殖形成神經(jīng)球。 應(yīng)用免疫組織化學(xué)和免疫熒光染色對(duì)培養(yǎng)的神經(jīng)球進(jìn)行巢蛋白抗原陽性鑒定。結(jié)果顯示所培養(yǎng)的神

4、經(jīng)球均呈巢蛋白抗原陽性，說明培養(yǎng)的細(xì)胞處于未分化狀態(tài)。將第三代神經(jīng)球置入含10％胎牛血清的分化液中，神經(jīng)球貼壁并且細(xì)胞從其周邊游出，分化形成神經(jīng)元樣或膠質(zhì)樣細(xì)胞。免疫染色顯示，分化的細(xì)胞中部分呈神經(jīng)絲200 抗原陽性，部分呈膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗原陽性，說明分化的細(xì)胞為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞。染色結(jié)果與形態(tài)學(xué)結(jié)合，證明所培養(yǎng)的細(xì)胞為神經(jīng)干細(xì)胞。 2、葡萄糖對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞增殖分化的影響 取體外培養(yǎng)的第三代神經(jīng)干細(xì)胞，在其條件培養(yǎng)基中分

5、別加入生理濃度（1.0g/L）和高濃度（4.5g/L）的葡萄糖，隨后應(yīng)用MTT 檢測(cè)，繪制在兩種葡萄糖濃度中，細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示神經(jīng)干細(xì)胞在生理濃度葡萄糖培養(yǎng)液中增殖能力更強(qiáng)，且兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。為了觀察葡萄糖對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響，分別將不同濃度葡萄糖中培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞，分別置入相應(yīng)含10％胎牛血清的生理濃度和高濃度葡萄糖分化液中誘導(dǎo)分化3d 和10d，行免疫熒光染色。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)分化3d

6、，與生理濃度葡萄糖相比，高濃度葡萄糖誘導(dǎo)生成更高比率的神經(jīng)絲200 抗原陽性細(xì)胞和膠質(zhì)纖維酸性蛋白抗原陽性細(xì)胞，同時(shí)有更低比率的巢蛋白抗原陽性細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；繼續(xù)誘導(dǎo)分化至10d，兩組未見巢蛋白抗原陽性細(xì)胞，說明已分化完全。比較兩組神經(jīng)絲200抗原陽性細(xì)胞比率，生理濃度葡萄糖血清分化液誘導(dǎo)生成的神經(jīng)絲200 抗原陽性細(xì)胞比率更高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明生理濃度葡萄糖更有利于提高神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力，而高濃度葡萄糖則加速了神經(jīng)

7、干細(xì)胞的早期分化，并最終降低了神經(jīng)元的分化率。 第二部分神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中bHLH基因的表達(dá)變化 取體外培養(yǎng)的第3 代神經(jīng)干細(xì)胞，置入明膠包被的6 孔板，全反義視磺酸誘導(dǎo)其分化。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)分別檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞及分化1d、2d、3d、5d 和10d bHLH 基因的表達(dá)變化。結(jié)果顯示：Hes1 mRNA 在NSCs 分化前后均表達(dá)，無顯著差異；Hes5 mRNA 隨分化時(shí)間的延長(zhǎng)表達(dá)下降；NeuroD m

8、RNA 和Mash1 mRNA 僅在已分化神經(jīng)細(xì)胞中較明顯的表達(dá)； NeuroD mRNA 的表達(dá)在全反義視磺酸誘導(dǎo)分化后約2d 較為顯著，在分化中期達(dá)到高峰；Math1 mRNA 在分化后期表達(dá)較明顯。從結(jié)果上看，神經(jīng)干細(xì)胞分化過程中，抑制型bHLH 基因表達(dá)逐漸減弱，激活型bHLH 基因表達(dá)逐漸增強(qiáng)。但對(duì)于每個(gè)bHLH 基因，即使是同一類型，其表達(dá)也存在著很大差異。同時(shí)，結(jié)合以往的研究：利用反義寡核苷酸鏈阻斷神經(jīng)干細(xì)胞中He