降鈣素預防去勢大鼠椎間盤退變的系列研究.pdf

1、骨質(zhì)疏松與椎間盤退變均以老齡人口為高發(fā)人群，尤其是絕經(jīng)后女性。目前關于骨量丟失與椎間盤退變的關系尚有爭議，許多研究表明，骨關節(jié)退變（OA）和骨質(zhì)疏松癥（OP）之間在四肢骨和脊柱主要存在負相關，Miyakoshi等通過骨密度檢測及椎間盤半定量評分發(fā)現(xiàn)絕經(jīng)后女性腰椎和股骨頸的骨密度與脊椎病的發(fā)生呈正相關性，Harada等的研究亦發(fā)現(xiàn)全身骨密度和腰椎骨密度均與椎間盤面積呈負相關性而與膨出率呈正相關性，并據(jù)此提出絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松患者椎間盤退變程度

2、更輕。然而另有研究發(fā)現(xiàn)骨量丟失明顯的絕經(jīng)后女性椎間盤退變程度也更為嚴重，腕部骨密度下降的程度與椎間盤退變呈正相關，椎體骨量丟失很可能是椎間盤退變的病因之一，國內(nèi)一項類似研究表明，除椎間盤膨出病例外，其余椎間盤突出，椎間盤脫出及椎管狹窄的構成比隨骨質(zhì)疏松程度加重而高，骨質(zhì)疏松嚴重程度與脊椎退行性病變臨床表現(xiàn)密切相關，提示臨床上治療腰椎退行變的同時，應積極治療骨質(zhì)疏松，才能有效的提高臨床療效。
　　 椎間盤退變的病理特征為軟骨終板、

3、髓核、纖維環(huán)的組成成分的改變，進而引起其生物力學性能的改變，并很可能最終導致軟骨終板或纖維環(huán)破裂進而發(fā)生椎間盤突出。作為椎間盤的毗鄰結構，椎體骨量和微觀結構的變化不僅會影響椎體本身的生物力學性能，也同時改變了椎間盤組織的生物力學環(huán)境，因此，去卵巢大鼠因為雌激素衰退導致骨轉換水平增高，骨吸收大于骨形成從而發(fā)生骨質(zhì)疏松，也會在降低椎體骨量的基礎上改變椎間盤的生物力學環(huán)境。另外，軟骨終板作為椎間盤與椎體的分界組織，其組織學病理改變比如鈣化不僅

4、可直接影響椎間盤的營養(yǎng)供應，也會引起椎間盤生物力學環(huán)境的改變進一步加速椎間盤退變的進程。
　　 椎間盤基質(zhì)成分合成和降解的失衡是其主要病理進程之一，基質(zhì)金屬蛋白酶-3（MMP-3）作為基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員之一，是主要的細胞外基質(zhì)降解酶，基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子-1（TIMP-1）作為MMP-3的拮抗因子，與MMP-3共同參與調(diào)節(jié)多種細胞外基質(zhì)的合成與降解，也因此與多種退行性疾病包括椎間盤退行性變的發(fā)生發(fā)展密切相關，二者活性和

5、功能的平衡狀態(tài)的改變是椎間盤退變的病理因素之一。
　　 降鈣素（CT）作為骨吸收抑制劑，可有效防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，也表現(xiàn)出了一定的保護軟骨的作用，但其是否有抑制椎間盤退變的作用罕見報道。鑒于骨質(zhì)疏松與椎間盤退變的關系尚存爭議，而降鈣素能否通過抑制骨吸收而延緩椎間盤的退變有待深入研究，因此本系列研究在驗證去卵巢大鼠骨量丟失與其椎間盤退變關系的基礎上，通過藥物干預進一步探討降鈣素對去卵巢大鼠椎體骨量丟失及椎間盤退變的保護作用，并通過

6、觀察椎體骨轉換水平、微觀結構、軟骨終板的組織學病理改變以及椎間盤組織中MMP-3及TIMP-1的表達的變化進一步明確其作用機制。
　　 第一部分去勢大鼠椎體骨量丟失與椎間盤退變關系的實驗研究
　　 骨質(zhì)疏松癥是以骨量減少、骨的微觀結構退化，致使骨脆性增加而易于發(fā)生骨折的一種全身性骨骼疾病。雌激素缺乏導致的高骨轉換最終會引起椎體骨量下降及微觀結構的退變，從而導致其力學性能的改變，同時作為椎間盤主要營養(yǎng)通路，軟骨終板也可能因

7、高骨轉換發(fā)生硬化而影響椎間盤營養(yǎng)供應。雖然絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松女性患者是否有更高的伴發(fā)椎間盤退變的幾率尚存爭議，但多數(shù)實驗支持椎體骨量丟失與椎間盤退變的發(fā)生呈正相關，而椎體骨量的丟失和骨微觀結構的退變，以及其生物力學性能的改變是否是椎間盤退變的病理因素之一，都有待研究證實。去卵巢大鼠是公認的應用最多的模擬人類絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的動物模型，本實驗中也以此為研究對象。
　　 目的:探討去卵巢大鼠雌激素缺乏及椎體骨量丟失對其椎間盤的影響。

8、>　　 方法:選取3月齡雌性Sprague-Dawley（SD）大鼠30只，體重210±32g，隨機分為三組：基礎對照（BL）組10只，在試驗開始時即處殺取材；卵巢切除（OVX）組10只，行雙側卵巢切除手術；假手術（Sham）組10只，行保留卵巢的對照手術。術后6個月處死大鼠，取腰椎L3-L5節(jié)段進行骨密度（BMD）檢測后，制備脫鈣石蠟切片，行HE染色，觀察椎間盤（L3-L4，L4-L5）的病理學改變并根據(jù)組織學評分系統(tǒng)對腰椎間盤的退

9、變（LVD）程度進行評分。
　　 結論:去卵巢大鼠腰椎骨密度下降的同時，椎間盤發(fā)生退變，椎體骨量丟失及終板鈣化進而改變椎間盤的生物力學環(huán)境和營養(yǎng)供應可能是椎間盤退變的病因之一。
　　 第二部分降鈣素對去勢大鼠椎間盤退變預防作用的實驗研究
　　 椎間盤是脊柱的重要承載結構，因其僅有少量血液供應，營養(yǎng)極為有限，從而極易退變。有研究表明，當軟骨終板承受高應力時可引起軟骨鈣化，進而減少椎間盤的營養(yǎng)供應，并最終導致椎間盤退

10、變發(fā)生，去卵巢大鼠椎間盤退變可能與終板變薄、鈣化進而影響了椎間盤的力學性能以及減少了椎間盤的營養(yǎng)供應有關。
　　 降鈣素是一種公認的骨吸收抑制劑，可有效防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松，研究發(fā)現(xiàn)降鈣素不僅可影響破骨細胞而且可以影響軟骨細胞的代謝和功能，而降鈣素能否通過改善椎間盤軟骨終板的代謝和維持椎體骨量及其生物力學性能從而延緩或抑制骨質(zhì)疏松大鼠椎間盤的退變？為明確這一問題，進行了本次動物實驗研究。
　　 目的:探討降鈣素對去卵巢大鼠

11、椎間盤退變的預防作用。
　　 方法:選取3月齡雌性SD大鼠30只，隨機均分為3組，每組10只：假手術（Sham）組10只，行保留卵巢的對照手術；卵巢切除（OVX）組10只，行雙側卵巢切除手術；降鈣素治療（OVX+CT）組10只，行卵巢切除術后第二天開始隔日皮下注射鮭魚降鈣素（降鈣素治療組，組），每次16 IU/kg。OVX組和Sham組進行安慰劑治療。所有大鼠于處死前10天和4天分別皮下注射四環(huán)素和鈣黃綠素作為雙熒光標記。6月后

12、處死動物取腰椎進行骨密度（L3-L5）和骨組織形態(tài)計量學（L2）分析，完成骨密度測定后，L3-L5腰椎及椎間盤進行脫鈣及常規(guī)石蠟包埋，行VG及番紅“O”染色，觀察椎間盤的病理學改變并根據(jù)組織學評分系統(tǒng)對腰椎間盤的退變（LVD）程度進行評分。
　　 結論:CT可有效抑制去卵巢大鼠椎間盤退變，其機制可能與直接對軟骨保護作用和維持椎體骨量及微觀結構、抑制終板退變從而改善椎間盤的生物力學環(huán)境和營養(yǎng)供應的間接作用有關。
　　 第三

13、部分降鈣素對去勢大鼠椎間盤MMP-3、TIMP-1表達影響的實驗研究
　　 基質(zhì)代謝失衡與椎間盤退變有密切關系，多種酶類和炎性介質(zhì)參與細胞外基質(zhì)的合成與降解代謝，包括基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）和基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑（TIMPs）。研究表明，MMPs參與降解所有細胞外基質(zhì)，在椎間盤軟骨退變過程中發(fā)揮重要作用。MMP-3在細胞外基質(zhì)成分的降解過程中起關鍵作用，其在椎間盤組織中的表達也一定程度上反映了椎間盤組織細胞的代謝狀態(tài)。TIMP

14、s是MMPs的特異性、內(nèi)源性抑制因子。研究發(fā)現(xiàn)MMP-3和TIMP-1平衡狀態(tài)的改變是椎間盤退變的因素之一，降鈣素對去勢大鼠椎間盤保護作用是否與影響MMP-3和TIMP-1在椎間盤組織中的表達水平從而調(diào)節(jié)椎間盤細胞外基質(zhì)的降解與合成有關有待進一步的研究。
　　 目的:通過觀察降鈣素干預后去勢大鼠椎間盤退變程度及椎間盤組織中MMP-3和TIMP-1的表達水平的改變，進一步探討降鈣素預防去勢大鼠椎間盤退變的作用機制。
　　

15、方法:選取3月齡SD大鼠30只，210±32g，隨機均分為3組，每組10只，20只大鼠進行雙側卵巢切除手術，10只大鼠進行保留卵巢的對照手術（對照組，Sham組）。一組卵巢切除組大鼠皮下注射鮭魚降鈣素20IU/kg/d治療（降鈣素治療組，OVX+CT組），卵巢切除組（OVX組）和對照組進行安慰劑治療。術后3個月處死所有大鼠，取L2-L4腰椎節(jié)段進行常規(guī)脫鈣并制備石蠟切片，行VG染色觀察椎間盤的病理學改變并根據(jù)組織學評分系統(tǒng)對腰椎間盤的退