nm23-H1基因調(diào)控人肺癌FAK信號通路及其分子機理的實驗研究.pdf

1、背景與目的肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快，對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤。肺癌也是發(fā)病率和死亡率非常接近的惡性腫瘤，其總的治愈率僅為10％-15％，90％以上的肺癌死亡是由于肺癌轉移造成的。肺癌侵襲和轉移是肺癌的惡性標志和特征，也是導致患者治療失敗和死亡的主要原因。因此，研究和闡明肺癌侵襲轉移的分子機理，尋找逆轉或/和抑制肺癌轉移的分子靶點，開發(fā)治療肺癌侵襲轉移的分子靶向藥物是未來肺癌研究領域的研究方向和重點課題，也是人類最終戰(zhàn)勝肺癌

2、的希望所在。周清華教授長期以來在該領域進行了較深入和系統(tǒng)的研究，首先提出了“肺癌轉移抑制級聯(lián)”的假說，建立了nm23-H1基因缺失的人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981、空載體轉染人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981-pLXSN和轉染nm23-H1基因的人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981-nm23-H1；證實了nm23-H1基因是“肺癌轉移抑制級聯(lián)”的上游基因和關鍵基因；通過體外及體內(nèi)實驗均證明了轉染nm23-H1基因可以逆轉人高轉移大細胞

3、肺癌細胞株L9981的惡性表型和轉移表型；nm23-H1基因通過調(diào)控RAS通路、PKC通路、PKA通路，WNT通路發(fā)揮腫瘤轉移抑制作用；本實驗研究的目的是在上述研究工作的基礎上，進一步探討nm23-H1基因調(diào)控下游信號分子FAK和通過FAK信號傳導系統(tǒng)發(fā)揮其抑止腫瘤轉移作用的分子機制。 材料與方法本研究應用Westernblot檢測人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981和人低轉移大細胞肺癌細胞株NL9980細胞FAK總蛋白和Tyr3

4、97FAK表達水平及差異；檢測人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981，空載體轉染人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981-pLXSN和轉基因人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981-nm23-H1細胞FAK總蛋白和Tyr397FAK表達水平及差異；應用Boyden小室和細胞遷移運動劃痕實驗檢測L9981、L9981-pLXSN和L9981-nm23-H1肺癌細胞株體外侵襲運動能力及差異；應用流式細胞術檢測L9981、L9981-pLXSN和L9981-

5、nm23-H1肺癌細胞株細胞骨架相關蛋白表達水平及差異。探討了nm23-H1基因調(diào)控FAK信號通路及其分子機理，為闡明肺癌侵襲轉移的分子機理，研究和開發(fā)針對肺癌侵襲轉移的分子靶向治療藥物提供理論基礎和實驗依據(jù)。 結果本研究在國內(nèi)外首次觀察到： 1、人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981和低轉移大細胞肺癌細胞株NL9980間FAK總蛋白表達水平比較無顯著性差異(P＞0.05)。 2、人高轉移大細胞肺癌細胞株L99813

6、97位磷酸化FAK蛋白表達水平顯著高于低轉移大細胞肺癌細胞株NL9980(P＜0.01)。 3、人原代高轉移大細胞肺癌細胞株L9981、轉染空載體的人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981-pLXSN和轉染nm23-H1基因的人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981-nm23-H1間FAK總蛋白表達水平比較無明顯差異(P＞0.05)。 4、轉染nm23-H1基因的人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981-nm23-H1397位磷酸化FAK

7、蛋白表達水平顯著低于人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981和轉染空載體的人高轉移大細胞肺癌株L9981-pLXSN(P＜0.01)，而L9981與L9981-pLXSN肺癌細胞株間Tyr397FAK表達水平比較無顯著性差異(P＞0.05)。 5、在轉染空載體的人高轉移大細胞肺癌株L9981-pLXSN和轉染nm23-H1基因的人高轉移大細胞肺癌細胞株L9981-nm23-H1中出現(xiàn)了一條約130KD的蛋白條帶。 6.nm23

8、-H1基因轉染可使L9981細胞株細胞偽足減少，折光性降低，并降低細胞粘附能力。 7.nm23-H1基因轉染可明顯降低L9981肺癌細胞株的體外侵襲能力及運動遷移能力。 8.nm23-H1基因轉染可明顯減少人肺癌細胞株L9981微絲的聚集，增加微管蛋白的聚合。 9.nm23-H1基因轉染人肺癌細胞株L9981后，可顯著下調(diào)整合素αv，α-actin基因的表達水平。 結論(1)人高轉移大細胞肺癌細胞株L99