重組人甲狀旁腺激素滲漏表達(dá)及酵母粉誘導(dǎo)表達(dá)的研究.pdf

1、人甲狀旁腺激素(ParathyroidHormone)是體內(nèi)調(diào)節(jié)鈣磷平衡的一種重要多肽類激素，能夠促進(jìn)骨質(zhì)的形成，增加骨基質(zhì)密度，是治療骨質(zhì)疏松癥的有效蛋白藥物。本文主要通過改變宿主菌大腸桿菌細(xì)胞膜的通透性，使胞內(nèi)的蛋白盡量滲透到培養(yǎng)基中進(jìn)行研究。同時就實驗過程中，在不添加誘導(dǎo)劑時，酵母粉誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)這一現(xiàn)象進(jìn)行研究。
　　 采用紫外誘變方法，初步得到具有分泌目標(biāo)蛋白到胞外的菌株，通過傳代培養(yǎng)穩(wěn)定該菌株的生物特性，分別從培養(yǎng)

2、基pH值、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時間、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間等方面進(jìn)行優(yōu)化發(fā)酵，本研究選用高滲的LB培養(yǎng)基37℃，200rpm搖床培養(yǎng)過夜，相同條件下高滲TB培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)，優(yōu)化發(fā)酵結(jié)果如下:培養(yǎng)基用自來水配制，培養(yǎng)基中蔗糖濃度為171g/L，pH調(diào)至7，37℃培養(yǎng)，培養(yǎng)5.5h后加誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度0.2mmol/L，誘導(dǎo)3.5h，Trx-hPTH的胞內(nèi)蛋白量達(dá)477mg/L。在以上優(yōu)化好的發(fā)酵條件下，本文研究了金屬鐵離子對蛋白表達(dá)的影響，

3、當(dāng)培養(yǎng)基中鐵離子濃度為1.0mmol/L時，人甲狀旁腺激素蛋白的表達(dá)量最高。
　　 本研究選用蔗糖作滲透劑，通過改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，研究外源蛋白的滲漏表達(dá)。當(dāng)培養(yǎng)基中蔗糖濃度256.5g/L時開始有少量蛋白滲漏到培養(yǎng)基中，蔗糖濃度達(dá)342g/L時，胞內(nèi)目標(biāo)蛋白大量滲漏于培養(yǎng)集中。當(dāng)用氯化鈉代替蔗糖后，SDS-PAGE分析胞外并無目標(biāo)蛋白產(chǎn)生，且胞內(nèi)蛋白的表達(dá)量也降低。
　　 本研究工程菌所用質(zhì)粒為pET32a，在不添

4、加IPTG的條件下，24g/LOXIOD酵母粉具有誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)的作用，其中起誘導(dǎo)作用的成分是極性化合物，分子量小于2000D，結(jié)合高效液相色譜法排除了是其含有乳糖起作用的可能，熱穩(wěn)定性好，高壓濕熱滅菌(121℃)后仍有誘導(dǎo)作用，并且需要被某物質(zhì)激活后才有活性，本文通過以下實驗得出結(jié)論。用蒸餾水配制的MTB培養(yǎng)基培養(yǎng)工程菌，無目標(biāo)蛋白表達(dá)，當(dāng)向其中加入蛋白胨、蔗糖或氯化鈉，或改用自來水配制培養(yǎng)基時，24g/LOXIOD酵母粉起誘導(dǎo)作用