姜黃素對膿毒癥急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、膿毒癥是機(jī)體由感染所引發(fā)的全身炎癥反應(yīng)綜合征，是各種嚴(yán)重創(chuàng)傷、燒傷、缺氧、再灌注損傷及外科大手術(shù)后常見的并發(fā)癥，是重癥監(jiān)護(hù)室患者的首位死亡原因。肺臟是膿毒癥時(shí)最易受損傷的靶器官，膿毒癥時(shí)急性肺損傷出現(xiàn)最早，發(fā)生率最高。膿毒癥時(shí)，由于內(nèi)毒素等刺激炎癥細(xì)胞產(chǎn)生大量的炎性介質(zhì)及脂質(zhì)代謝產(chǎn)物，促使炎性反應(yīng)細(xì)胞尤其是中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在肺組織中募集和活化，進(jìn)一步產(chǎn)生細(xì)胞因子、趨化因子、氧自由基及蛋白酶等，擴(kuò)大炎性反應(yīng)，形成瀑布樣級聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致肺

2、泡上皮細(xì)胞及血管內(nèi)皮細(xì)胞受損、通透性增加，影響細(xì)胞間隙、水鈉轉(zhuǎn)運(yùn)及表面活性物質(zhì)的產(chǎn)生，大量富含蛋白及細(xì)胞成分的液體以較快速度進(jìn)入肺組織，形成滲透性肺水腫，導(dǎo)致透明膜形成和肺泡塌陷，并伴有肺間質(zhì)纖維化。
　　 姜黃素(Curcumin，Cur)是姜黃類植物中提取的一種多酚，具有廣泛的藥理作用，傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中應(yīng)用于惡性腫瘤、糖尿病、風(fēng)濕病等。近年的研究揭示其具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基、抗纖維化以及防癌抗癌等作用，可能與其抑制NF-κ

3、B和激活劑蛋白-1(AP-1)等轉(zhuǎn)錄因子的激活及表達(dá)有關(guān)，而且無明顯的毒副作用。研究表明姜黃素在炎癥性疾病的治療上有廣闊的應(yīng)用前景。但目前，姜黃素抗炎的生化基礎(chǔ)及路徑仍未闡明，能否作為膿毒癥急性肺損傷的治療用藥也須作進(jìn)一步評價(jià)。
　　 本研究擬利用大鼠盲腸結(jié)扎穿刺(CLP)致膿毒癥急性肺損傷(ALI)的動(dòng)物模型，從整體動(dòng)物和分子水平觀察姜黃素治療膿毒癥急性肺損傷后肺換氣功能的改變、肺通透性變化、髓過氧化物酶(MPO)、超氧化物歧

4、化酶(SOD)及丙二醛(MDA)水平、病理學(xué)指標(biāo)以及細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6及ICAM-1、MIP2的變化，并結(jié)合NF-κB及MAPK三條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(ERK、JNK和p38MAPK)的變化等，旨在闡明姜黃素治療膿毒癥急性肺損傷的機(jī)制，為膿毒癥急性肺損傷的預(yù)防和臨床救治提供一種新的研究思路。
　　 第一部分姜黃素對膿毒癥急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用
　　 目的:觀察姜黃素對膿毒癥急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用。<

5、br>　　 方法:采用盲腸結(jié)扎穿刺致膿毒癥急性肺損傷大鼠模型。SD大鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組;模型對照組;溶媒干預(yù)組;低(50mg/kg)、高劑量(200mg/kg)姜黃素干預(yù)組。術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)(6h、12h、24h)處死大鼠8只收集血液及肺組織標(biāo)本。測定實(shí)驗(yàn)各組多項(xiàng)動(dòng)脈血?dú)庵笜?biāo)、肺水含量（肺濕干重比）、支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量及細(xì)胞（總數(shù)，中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞）計(jì)數(shù)、光鏡觀察肺組織病理形態(tài)變化、測定肺組織中超氧化物歧化酶(SOD)

6、、丙二醛(MDA)水平及髓過氧化物酶(MPO)活性及細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6水平，并比較觀察實(shí)驗(yàn)各組72小時(shí)生存率。
　　 結(jié)果:
　　 1.與假手術(shù)對照組比較，模型組各項(xiàng)指標(biāo)均出現(xiàn)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著改變:表明本研究制備的膿毒癥致ALI模型成功可靠。與假手術(shù)對照組比較，(1)模型組大鼠肺部氣體交換功能降低，表現(xiàn)為PaO2/FiO2和PaO2均顯著降低(P＜0.05或P＜0.01);(2)模型組大鼠肺泡上

7、皮細(xì)通透性及微血管通透性增加，表現(xiàn)為肺水含量（肺濕干重比）、BALF中的蛋白含量及細(xì)胞（總數(shù)，中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞）計(jì)數(shù)明顯增高(P＜0.05或P＜0.01);(3)模型組大鼠發(fā)生明顯炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為肺組織病理評分明顯增高，BALF細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6水平明顯增高(P＜0.05或P＜0.01);(4)模型組大鼠肺部中性粒細(xì)胞浸潤、氧自由基增多及抗氧化能力減弱，表現(xiàn)為模型組MPO活力水平及MDA水平明顯增高，而SOD水

8、平下降(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 2.與模型組比較，不同劑量姜黃素干預(yù)組多項(xiàng)反應(yīng)肺組織損傷的指標(biāo)均得到顯著改善，高劑量組效果基本上都優(yōu)于低劑量組。與模型組比較:(1)姜黃素干預(yù)能改善大鼠肺部氣體交換功能，不同劑量姜黃素干預(yù)組大鼠PaO2/FiO2和PaO2均有顯著改善(P＜0.05或P＜0.01)，提高了肺組織的氧合狀況。(2)姜黃素干預(yù)能抑制大鼠肺泡上皮細(xì)胞通透性及微血管通透性的惡性增加，不同劑量的姜黃素均能夠顯著

9、降低CLP誘導(dǎo)ALI大鼠肺水含量（肺濕干重比）、BALF中的蛋白含量、細(xì)胞（總數(shù)，中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞）計(jì)數(shù)上調(diào)的指標(biāo)(P＜0.05或P＜0.01)。(3)姜黃素干預(yù)能抑制大鼠炎癥反應(yīng)，不同劑量姜黃素干預(yù)組肺組織病理評分顯著降低，不同劑量姜黃素干預(yù)組能夠不同程度抑制CLP致ALI的BALF細(xì)胞因子TNF-α、 IL-1β、IL-6水平(P＜0.01)，抑制肺部炎癥反應(yīng)。(4)姜黃素干預(yù)能抑制肺部中性粒細(xì)胞浸潤及氧化應(yīng)激反應(yīng)，不同劑量姜黃

10、素干預(yù)組MPO活力水平及MDA水平均顯著的降低， SOD活性水平卻顯著上升(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 3.假手術(shù)對照組、模型組及姜黃素干預(yù)組72h生存率觀察發(fā)現(xiàn)姜黃素干預(yù)組能有效提高CLP大鼠72h生存率:其中50mg/kg劑量組72h生存率為80％，較CLP組提高了40％;200mg/kg劑量組72h生存率為90％，較CLP組提高了50％;而溶媒干預(yù)組72h生存率為40％，與CLP組相同。
　　 結(jié)論:

11、r>　　 姜黃素通過減輕膿毒癥ALI大鼠肺部微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，改善肺部氣體交換功能，抑制ALI大鼠肺部炎癥反應(yīng)和通透性增高等對膿毒癥ALI大鼠發(fā)揮保護(hù)作用;最終顯著提高大鼠的生存率。
　　 第二部分姜黃素在膿毒癥急性肺損傷大鼠中對IKK/NF-κB信號通路的影響
　　 目的:通過觀察姜黃素對膿毒癥急性肺損傷大鼠中IKK/NF-κB信號通路的影響，探討其對膿毒癥急性肺損傷保護(hù)作用的分子機(jī)制。
　　 方法:SD大

12、鼠隨機(jī)分為3組（每組10只）:假手術(shù)組;模型對照組;姜黃素干預(yù)組（200mg/kg）。CLP術(shù)后12h后，收集血液及肺組織標(biāo)本。ELISA法檢測血清中TNF-α、ICAM-1及MIP-2水平;RT-PCR檢測肺組織TNF-α、ICAM-1及MIP-2 mRNA的表達(dá);EMSA法檢測肺組織NF-κB DNA結(jié)合活性;Werstern blotting測定肺組織細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65和肺組織中p-IKKser180/βser181和Iκ

13、Bα蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1.與假手術(shù)對照組比較，模型組血清TNF-α、ICAM-1及MIP-2水平和肺組織TNF-α、ICAM-1及MIP-2mRNA的表達(dá)均明顯增加(P＜0.05或P＜0.01);與假手術(shù)對照組比較，模型組肺組織NF-κB DNA結(jié)合活性和肺組織細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白及肺組織p-IKKser180/βser181蛋白水平明顯增加(P＜0.05或P＜0.01)，肺組織IκBα含量明顯

14、降低(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 2.與模型組比較，姜黃素干預(yù)組血清TNF-α、ICAM-1及MIP-2水平和肺組織TNF-α、ICAM-1及MIP-2 mRNA的表達(dá)均明顯降低(P＜0.05或P＜0.01);與模型組比較，姜黃素干預(yù)組肺組織NF-κB DNA結(jié)合活性和肺組織細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65蛋白及肺組織p-IKKser180/βser181蛋白水平明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)，肺組織IκBα含量明顯

15、升高(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 姜黃素對膿毒癥ALI大鼠的保護(hù)作用可能與其抑制IKK/NF-κB信號通路減少相關(guān)炎性基因和蛋白表達(dá)有關(guān)。
　　 第三部分姜黃素在膿毒癥急性肺損傷大鼠中對MAPK信號通路的影響
　　 目的:通過觀察姜黃素對膿毒癥急性肺損傷大鼠中MAPK(ERK、JNK和p38MAPK)信號通路的影響，探討其對膿毒癥急性肺損傷保護(hù)作用的分子機(jī)制。
　　 方法:

16、SD大鼠隨機(jī)分為4組（每組6只）:假手術(shù)組;模型對照組;姜黃素干預(yù)組(200mg/kg)。CLP術(shù)后12h后，收集血液及肺組織標(biāo)本。免疫組織化學(xué)染色和Werstern blotting檢測pERK、pJNK及pp38MAPK蛋白表達(dá);RT-PCR檢測肺組織TNF-α mRNA的表達(dá);ELISA檢測血清中TNF-α水平。
　　 結(jié)果:
　　 1.與假手術(shù)對照組比較，模型組肺組織pERK、pJNK及pp38MAPK和TNF-

17、αmRNA的表達(dá)水平及血清中TNF-α水平均明顯增加(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 2.與模型組比較，姜黃素干預(yù)組肺組織pERK、pJNK及pp38MAPK和TNF-αmRNA的表達(dá)水平及血清中TNF-α水平明顯降低(P＜0.05或P＜0.01)。
　　 結(jié)論:
　　 姜黃素對膿毒癥ALI大鼠的保護(hù)作用可能與其抑制MAPK三條信號通路（ERK、JNK和p38MAPK）的活化，減少相關(guān)炎性基因和蛋白表達(dá)有關(guān)