低分子肝素對膿毒癥誘導(dǎo)的急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用研究.pdf

1、本文主要從以下幾個(gè)部分展開論述：
　　第一章 低分子肝素對膿毒癥誘導(dǎo)的大鼠ALI的保護(hù)作用
　　目的:評價(jià)低分子肝素對膿毒癥誘導(dǎo)的大鼠ALI有無保護(hù)作用。
　　方法:將雄性Wistar大鼠隨機(jī)分組如下:假手術(shù)(Sham)組;CLP模型組;LMWH小劑量(75 U/Kg-1)治療組，LMWH中劑量（150 U/Kg-1）治療組和LMWH大劑量(300U/Kg-1)治療組;每組30只。術(shù)后觀察并記錄大鼠行為、生命體征、生存

2、率等情況，于造模后6h、12h及24h收集各組支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavagefluid，BALF)、血清及肺組織。行動(dòng)脈血?dú)夥治鲇^察氧分壓(pressure of oxygen，PO2)的變化;肺組織標(biāo)本行形態(tài)學(xué)研究，通過大體標(biāo)本、HE染色和Masson染色觀察肺水腫、肺炎癥細(xì)胞浸潤、肺出血及膠原蛋白在間質(zhì)沉積的情況;肺組織水腫通過組織水含量評價(jià);通過血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)各組BALF中各炎癥細(xì)胞的數(shù)量;二喹啉甲

3、酸(Bicinchoninic acid，BCA)法測定BALF中的蛋白濃度;測定各組肺組織MPO活性，酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay，ELISA)法測肺組織ICAM-1水平，放射免疫法測定血中TNF-α、IL-1β的含量。
　　結(jié)果:
　　1.LMWH對大鼠一般狀況的影響:膿毒癥大鼠CLP術(shù)后4h開始出現(xiàn)弓背、活動(dòng)減少，進(jìn)食量減少，精神萎靡等表現(xiàn)，6h后大鼠出現(xiàn)呼吸急促

4、，約120-150次/min，部分存在咳嗽、弓背、前肢縮抬現(xiàn)象，12h后呼吸急促進(jìn)行性加重，約200-250次/min，口唇、耳梢及四肢末梢可見發(fā)紺，皮毛失光澤、立毛，隨病情進(jìn)展嚴(yán)重者可出現(xiàn)呼吸節(jié)律不規(guī)則，俯伏不動(dòng)等表現(xiàn)。解剖腹腔示:腹腔出血傾向明顯，近段腸管擴(kuò)張，被結(jié)扎的盲腸顏色灰暗，肝腫大、肺充血明顯，部分大鼠存在腸系膜粘連、血性腹水并伴惡臭;低分子肝素不同劑量治療組大鼠呼吸急促及活動(dòng)情況均較CLP組明顯減輕;解剖腹部可見肝臟輕度腫

5、大，肺輕度充血，HLMWH治療組出血傾向明顯;Sham組沒有相關(guān)表現(xiàn)。
　　2.各組大鼠呼吸頻率變化:①造模后，CLP組與同時(shí)間點(diǎn)Sham組相比，大鼠的呼吸頻率逐漸升高，組間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01); CLP組組內(nèi)12h到24h時(shí)大鼠呼吸窘迫最明顯，12h時(shí)、24h時(shí)較6h時(shí)大鼠呼吸頻率明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，但CLP組12h時(shí)與24h時(shí)無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);②經(jīng)治療后，LLMWH治療組

6、的大鼠呼吸頻率與CLP組相比，在各時(shí)間點(diǎn)均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);而其余兩組治療組僅在12h時(shí)和24h時(shí)，與CLP組大鼠相比，呼吸頻率均下降，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);③同時(shí)間點(diǎn)內(nèi)，LMWH治療組不同劑量組間相比，大鼠呼吸頻率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);
　　3.各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)PO2變化:①造模后，CLP組與同時(shí)間點(diǎn)Sham組相比，大鼠的血?dú)釶O2明顯下降，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);其中CLP組

7、組內(nèi)12h時(shí)PO2下降最低，12h較6h時(shí)PO2減低，組內(nèi)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);12h時(shí)與24h時(shí)PO2相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞O.05);6h時(shí)與24h時(shí)PO2相比，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);②經(jīng)治療后，MLMWH治療組、HLMWH治療組與CLP組相比，PO2在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)均升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中12h時(shí)，差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);LLMWH治療組在12h時(shí)，較CLP組大鼠的PO2升高，

8、有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，6h和24h時(shí)與CLP組相比，PO2無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　研究結(jié)論:
　　1.本研究通過大鼠CLP術(shù)可以成功復(fù)制膿毒癥合并ALI的病理生理過程。且發(fā)現(xiàn)在術(shù)后12h時(shí)CLP組肺水腫程度最高、炎癥細(xì)胞浸潤最重，血中及肺組織中炎癥因子表達(dá)水平最高，提示ALI的損傷程度最重，可為后續(xù)研究提供理論基礎(chǔ)。
　　2.低分子肝素治療組能夠通過對血中TNF-α、IL-1β和肺組織中ICAM-1

9、水平的抑制，降低ALI的炎癥程度，改善了CLP導(dǎo)致的微結(jié)構(gòu)改變，減輕了CLP致ALI的肺水腫，改善了肺部氣體交換功能，起到了肺保護(hù)功能。
　　3.中劑量低分子肝素治療組(150IU/Kg-1)遠(yuǎn)期效果優(yōu)于高、低劑量治療組，改善ALI大鼠的生存率最明顯。
　　第二章 LMWH對CLP誘導(dǎo)的大鼠膿毒癥ALI模型的保護(hù)機(jī)制研究
　　目的:評估LMWH對CLP誘導(dǎo)的大鼠ALI的保護(hù)作用機(jī)制是否是通過抑制TLR4-MyD88-N

10、F-κB信號通路發(fā)揮抗炎癥的效果。
　　方法:參考本實(shí)驗(yàn)第一部分，所有大鼠隨機(jī)分為3組，每組20只:Sham組，CLP組和CLP+LMWH治療組(150 U/Kg-1)。造模后12h收集血液和肺組織，肺組織標(biāo)本行形態(tài)學(xué)研究，肺組織中ICAM-1的表達(dá)采用ELISA法檢測，血中炎癥因子TNF-α及IL-1β的檢測采用放射免疫法，Western-Blot法測定肺組織中肺組織中TLR4-MyD88-NF-κB信號通路的相關(guān)蛋白的表達(dá)，定

11、量反轉(zhuǎn)錄聚合酶連鎖反應(yīng)(quantificational reverse transcription-polymerase chain reaction，qRT-PCR)法測定肺組織中TNF-α、IL-1β和ICAM-1 mRNA的表達(dá)。
　　結(jié)果:1.肺組織病理學(xué)變化:假手術(shù)組支氣管粘膜上皮完整，肺泡腔干凈，肺小葉結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁無增厚，肺泡間質(zhì)內(nèi)無炎性細(xì)胞浸潤，纖維結(jié)締組織無增生;CLP模型組:肺小葉結(jié)構(gòu)不清，肺泡腔內(nèi)有出血和

12、滲出，肺泡壁增厚，肺泡間質(zhì)內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤，纖維結(jié)締組織增生，支氣管粘膜上皮不完整。CLP+LMWH治療組:肺泡腔有少量出血和滲出，氣管上皮細(xì)胞接近完整，部分肺小葉結(jié)構(gòu)清晰，肺泡壁輕度增厚，肺泡間質(zhì)中炎癥細(xì)胞的浸潤減少，檢測到少量增生的纖維結(jié)締組織。
　　2.血漿中細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β和IL-6的表達(dá):CLP組血漿中細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β和IL-6的表達(dá)明顯高于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而在

13、CLP+LMWH組炎癥因子的表達(dá)明顯低于CLP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.ICAM-1的檢測:與CLP模型組相比，ICAM-1的水平顯著高于Sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而與CLP組相比，ICAM-1在CLP+ LMWH組的表達(dá)明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　4.血漿中細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β的表達(dá):CLP組血漿中細(xì)胞因子TNF-α，IL-1β和IL-6的表達(dá)顯著高

14、于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而在LMWH組明顯低于CLP組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　5.ICAM-1的檢測:CLP組ICAM-1的水平明顯高于sham組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而與CLP組相比，ICAM-1在LMWH組的表達(dá)明顯減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　6.肺組織中炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)水平:
　　6.1.TLRs信號通路相關(guān)蛋白表達(dá):①TLR-4蛋白水平:

15、CLP組大鼠肺組織TLR-4蛋白水平較Sham組升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);LMWH治療組較CLP組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);②MyD88蛋白水平:CLP組大鼠肺組織MyD88蛋白水平較Sham組升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);LMWH治療組較CLP組明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);（見圖3-3）
　　6.2.NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá):①NF-κB通路調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá):

16、CLP組大鼠肺組織IKKα、IKKβ和IκBα蛋白水平均較Sham組升高，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);LMWH治療組較CLP組明顯降低(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;②NF-κB蛋白在CLP組的表達(dá)顯著高于Sham組和CLP+ LMWH組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　7.肺組織IL-1β mRNA、TNF-α mRNA和ICAM-1 mRNA的表達(dá):CLP組大鼠肺組織IL-1β mRNA、TNF-α mR