氟康唑與萬(wàn)古霉素等抗菌藥物聯(lián)用對(duì)CA-SA混合BF的作用及機(jī)制研究.pdf

1、近年來(lái)隨著醫(yī)療技術(shù)的進(jìn)步，醫(yī)療植入體如導(dǎo)管、人工瓣膜和關(guān)節(jié)置換物等用于臨床治療的幾率增加，病原菌粘附在醫(yī)療植入體表面形成生物膜(biofilm，BF)，造成BF相關(guān)的感染發(fā)病率上升。白色念珠菌（Candidaalbicans，CA）、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)是導(dǎo)管相關(guān)BF感染的常見分離菌，且有時(shí)呈混合感染。BF的形成使BF內(nèi)的菌極強(qiáng)的耐藥性和抵抗機(jī)體免疫系統(tǒng)作用的能力，耐藥性大大增強(qiáng)，治療難度增大

2、。目前，由于研究新型抗菌藥物耗資巨大，研究周期較長(zhǎng)，聯(lián)合用藥成為解決BF相關(guān)的耐藥問題的研究熱點(diǎn)之一。
　　 目的:
　　 通過測(cè)定萬(wàn)古霉素、米諾環(huán)素、利福平、左氧氟沙星、磷霉素和阿奇霉素與氟康唑(FLC)聯(lián)合應(yīng)用對(duì)浮游與成膜的CA與SA混合生長(zhǎng)的體外聯(lián)合抗菌效果，以及鈣調(diào)節(jié)劑對(duì)聯(lián)合用藥的影響，尋找能夠抗混合BF感染的藥物組合，并進(jìn)行機(jī)制探討。
　　 方法:
　　 選取耐藥CA與耐藥SA(R-R)，耐藥C

3、A與敏感SA(R-S)、敏感CA與耐藥SA(S-R)及敏感CA與敏感SA(S-S)形成的混合BF為研究對(duì)象，采用微量稀釋法分別測(cè)定FLC與抗菌藥物萬(wàn)古霉素、米諾環(huán)素、利福平、左氧氟沙星、磷霉素和阿奇霉素聯(lián)合對(duì)混合菌的浮游及成膜狀態(tài)的作用，以肉眼觀察法與XTT（OD值）法兩種方法判定作用效果，利用非參數(shù)法（FICI與△E）分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并以FLC及抗菌藥物單用抗CA-SA混合BF的作用、聯(lián)合用藥抗CA及SA單一菌的作用和藥物單用抗單一菌的

4、效果為對(duì)照組，綜合評(píng)價(jià)聯(lián)合用藥的作用效果。
　　 以平板畫線法篩選對(duì)聯(lián)合用藥抗不同敏感程度CA與SA混合生物膜作用有增效作用的鈣離子調(diào)節(jié)劑，并用微量稀釋法測(cè)定鈣調(diào)節(jié)劑與FLC及抗菌藥物三藥合用抗混合浮游菌及其對(duì)混合BF的作用效果。通過對(duì)比鈣離子調(diào)節(jié)劑與FLC、鈣離子調(diào)節(jié)劑與抗菌藥物合用以及抗菌藥物與FLC合用抗混合BF的作用，綜合評(píng)價(jià)鈣離子調(diào)節(jié)劑對(duì)FLC聯(lián)合抗菌藥物抗混合BF作用的影響。
　　 利用transwell膜將

5、藥物作用后的混合菌液分離，分別評(píng)價(jià)藥物對(duì)混合BF中CA及SA的作用;通過干重法測(cè)定FLC與萬(wàn)古霉素等抗菌藥物合用后混合BF基質(zhì)含量，對(duì)比生長(zhǎng)對(duì)照、FLC單用及抗菌藥物單用時(shí)基質(zhì)含量的變化，聯(lián)合用藥對(duì)混合BF細(xì)胞外基質(zhì)影響;以“三明治”法評(píng)價(jià)聯(lián)合用藥時(shí)FLC及抗菌藥物透過耐藥及敏感混合BF的量，通過對(duì)比FLC及抗菌藥物單用時(shí)藥物透過混合BF的量，以及聯(lián)合用藥透過CA或SA單BF的量，分析聯(lián)合用藥產(chǎn)生的協(xié)同作用是否與影響藥物透過生物膜的量有

6、關(guān);應(yīng)用PCR技術(shù)評(píng)價(jià)混合BF中菌絲編碼蛋白Hwp1在不同用藥組（混合BF生長(zhǎng)對(duì)照組、單CABF對(duì)照組、FLC單用組、抗菌藥物單用組、FLC與抗菌藥物合用組）的表達(dá)改變，觀察聯(lián)合用藥協(xié)同作用機(jī)制是否是通過影響CA菌絲生長(zhǎng)從而抑制混合BF形成。并綜合上述結(jié)果分析聯(lián)合用藥協(xié)同抗混合BF相關(guān)的機(jī)制。
　　 結(jié)果:
　　 FLC單用和抗菌藥物單用時(shí)沒有明顯的抗浮游混合菌及混合BF的作用;以FICI法評(píng)價(jià)聯(lián)合用藥作用時(shí)發(fā)現(xiàn):對(duì)于浮

7、游的CA-SA混合菌，氟康唑與米諾環(huán)素合用時(shí)對(duì)于敏感和耐藥的CA及SA混合菌具有較強(qiáng)的抗菌作用;FLC與萬(wàn)古霉素合用時(shí)，對(duì)于敏感和耐藥的混合浮游菌均具有良好的協(xié)同作用，合用時(shí)萬(wàn)古霉素的最低有效濃度(MIC)高于單用時(shí)抗單一SA菌的MIC;當(dāng)與FLC合用時(shí)，磷霉素和左氧氟沙星抗混合菌的作用結(jié)果相似，只對(duì)敏感的CA所形成的混合菌起效;而利福平與FLC合用時(shí)，只對(duì)敏感的SA所形成的混合菌起效;阿奇霉素與氟康唑合用時(shí)，抗混合菌的作用不明顯，無(wú)協(xié)

8、同作用。利用△E法評(píng)價(jià)聯(lián)合用藥抗混BF時(shí)發(fā)現(xiàn)，對(duì)于不同敏感程度的混合BF抗菌藥物與FLC合用時(shí)各個(gè)濃度點(diǎn)的△E均大于0，當(dāng)FLC和抗菌藥物的濃度高于MIC值時(shí)，△E顯著增大，并且聯(lián)合用藥抗R-R組的△E明顯高于其他組。
　　 FLC與抗菌藥物合用對(duì)不同成膜時(shí)間的CA-SA混合BF作用效果不同，2h、4h和8h形成的BF與浮游菌作用效果相近，但對(duì)于成膜時(shí)間為24h的混合BF聯(lián)合用藥幾乎沒有作用。對(duì)比聯(lián)合用藥抗成膜時(shí)間為8h和12h

9、的CA-SA混合BF的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)米諾環(huán)素與FLC合用具有最強(qiáng)的作用效果，對(duì)敏感及耐藥的混合BF都具有良好的抗菌作用;萬(wàn)古霉素、左氧氟沙星與FLC合用時(shí)，對(duì)于耐藥CA與敏感SA、敏感CA與耐藥SA及敏感CA與敏感SA形成的混合BF具有良好的協(xié)同作用，但對(duì)于耐藥菌形成的混合BF作用微弱;當(dāng)與FLC合用時(shí)，阿奇霉素的作用弱于萬(wàn)古霉素和左氧氟沙星，僅對(duì)敏感CA形成的混合BF(S-R，S-S)有效;磷霉素和利福平與FLC合用對(duì)混合BF的作用較差，

10、僅對(duì)敏感菌形成的混合BF(S-S)有效。對(duì)比聯(lián)合用藥抗混合BF與浮游菌的作用發(fā)現(xiàn)，BF的形成可使藥物作用減弱，生物膜越成熟作用效果越弱。然而，利用△E法評(píng)價(jià)聯(lián)合用藥抗混BF時(shí)發(fā)現(xiàn)，抗菌藥物與FLC合用時(shí)的各個(gè)濃度點(diǎn)的△E均大于0，當(dāng)FLC和抗菌藥物的濃度升高，△E顯著增大。
　　 平板劃線法研究表明，鈣通道阻滯劑貝尼地平、鈣離子螯合劑EDTA對(duì)不同敏感程度的CA與SA混合生長(zhǎng)均具有抑制作用，可以增強(qiáng)FLC與米諾環(huán)素聯(lián)合用藥抗混合

11、BF的作用;EDTA的作用明顯強(qiáng)于貝尼地平。當(dāng)貝尼地平的濃度為4μg/ml，EDTA為0.25mM時(shí)，可以顯著增加聯(lián)合用藥的抗浮游混合菌和混合BF的作用，降低聯(lián)合用藥中米諾環(huán)素和FLC的最低有效濃度。
　　 分別評(píng)價(jià)FLC與米諾環(huán)素用藥對(duì)混合BF中CA和SA的作用，通過對(duì)比R-R與R-S組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)SA的耐藥性可以影響混合生物膜中CA的耐藥性，即在相同濃度的FLC與抗菌藥物作用下與耐藥SA所形成的混合BF中的CA數(shù)量多于與敏

12、感SA所形成的混合BF中CA的量;比較相同藥物組合濃度作用后的R-R與S-R組中SA的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，混合BF中SA的量主要與抗菌藥物濃度有關(guān)，CA的量越多對(duì)SA的量也增加，但是影響不顯著。當(dāng)聯(lián)合用藥中抗菌藥物的濃度大于MIC時(shí)，才具有良好的抗SA的作用;而CA在藥物合用濃度較低（小于FLC抗單菌的MIC）時(shí)生長(zhǎng)明顯被抑制;在同一濃度的抗菌藥物作用后，混合BF中的SA數(shù)量隨著CA的數(shù)量增大（FLC濃度降低）而增多。
　　 FLC單用對(duì)

13、混合BF細(xì)胞外基質(zhì)有一定的抑制作用，但作用弱于FLC與抗菌藥物合用效果。單用米諾環(huán)素細(xì)胞外基質(zhì)的形成增多，但聯(lián)合用藥時(shí)FLC與米諾環(huán)素合用可明顯降低細(xì)胞外基質(zhì)的含量;利福平與FLC合用，抗細(xì)胞外基質(zhì)形成的作用較為顯著，但利福平單用對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的形成也有一定的抑制作用;萬(wàn)古霉素與FLC合用抗細(xì)胞外基質(zhì)形成的作用明顯強(qiáng)于萬(wàn)古霉素單用，但相比于生長(zhǎng)對(duì)照及FLC單用萬(wàn)古霉素與FLC合用的協(xié)同作用較弱;磷霉素與阿奇霉素的作用效果相似，單用抗菌藥物

14、時(shí)混合BF細(xì)胞外基質(zhì)與生長(zhǎng)對(duì)照相比含量減少，并且與FLC合用時(shí)，可以增強(qiáng)抗細(xì)胞外基質(zhì)形成的作用，但聯(lián)合用藥的作用效果并不顯著。
　　 聯(lián)合用藥藥物透過后所產(chǎn)生的抑菌圈大小主要與含藥平板中的藥物濃度有關(guān)，而與混合生物膜的敏感程度無(wú)密切相關(guān)，不同敏感程度的混合BF間藥物透過量差別較小;并且藥物透過單一BF的作用結(jié)果與藥物透過混合BF所產(chǎn)生的抗CA抑菌圈大小相近。米諾環(huán)素、利福平與FLC合用時(shí)可以觀察到聯(lián)合用藥與FLC單用相比增加了抗

15、CA抑菌圈;對(duì)于SA鋪就的菌板，抗菌藥物單用及與FLC合用時(shí)透膜后產(chǎn)生的抑菌圈大小無(wú)肉眼可見的明顯區(qū)別，與抗菌藥物單用抗SA的作用相似。
　　 對(duì)比FLC單用、米諾環(huán)素單用及FLC與米諾環(huán)素合用組與生長(zhǎng)對(duì)照間混合菌總RNA中菌絲編碼蛋白HWP1的表達(dá)量沒有顯著差異;聯(lián)合用藥的不同作用時(shí)間(6h、12h和24h)之間不同藥物作用的HWP1的表達(dá)量差別較小。
　　 結(jié)論:
　　 1.萬(wàn)古霉素、米諾環(huán)素、利福平、左氧氟

16、沙星、磷霉素及阿奇霉素與FLC合用可以產(chǎn)生協(xié)同抗CA-SA混合浮游菌和混合BF生長(zhǎng)的作用。其中，米諾環(huán)素與FLC合用效果最為顯著，可以顯著降低藥物抗混合BF的SMIC。阻斷細(xì)胞鈣離子通道及降低細(xì)胞外鈣離子濃度均可增加米諾環(huán)素與FLC聯(lián)合抗混合菌的作用。
　　 2.混合BF的形成會(huì)增加CA和SA的耐藥性，聯(lián)合用藥通過殺滅混合BF中的CA，破壞BF的屏障作用增加藥物對(duì)SA的作用;聯(lián)合用藥抗混合菌可以減少混合BF細(xì)胞外基質(zhì)的含量，但不

17、增加藥物透過BF的能力，也不影響CA菌絲編碼蛋白HWP1的表達(dá)量。聯(lián)合用藥的協(xié)同作用機(jī)制并不是通過抑制CA菌絲生成而起到減少BF細(xì)胞外基質(zhì)的作用，也不是通過增加藥物透膜量起到協(xié)同抗混合BF的作用;聯(lián)合用藥的協(xié)同作用可能與影響細(xì)胞內(nèi)鈣離子平衡有關(guān)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　 總之，抗菌藥物萬(wàn)古霉素、利福平、米諾環(huán)素、左旋氧氟沙星、磷霉素和阿奇霉素與FLC合用聯(lián)合時(shí)對(duì)浮游狀態(tài)及形成BF混合菌均表現(xiàn)出協(xié)同作用，對(duì)敏感性不同的CA