同時(shí)特異結(jié)合APP上BACE1酶切位點(diǎn)及Aβ的scFv的篩選及其功能研究.pdf

1、阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease，AD)是一種年齡相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床癥狀包括記憶缺失、短時(shí)程記憶損傷、認(rèn)知能力下降、行為異常和語言能力障礙等。β淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)的積累和聚集被認(rèn)為是AD發(fā)病機(jī)制中的主要原因，因此減少Aβ的產(chǎn)生、抑制Aβ聚集及毒性和加快Aβ清除率是預(yù)防AD和減緩病情發(fā)展的有效途徑。Aβ是β淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)的酶解

2、產(chǎn)物，由β分泌酶(β-siteamyloid precursor protein cleaving enzyme1，BACE1)和γ分泌酶共同作用產(chǎn)生，因此抑制這兩種酶或其中的一種酶的活性一般被認(rèn)為是治療AD比較有希望的途徑。然而γ分泌酶結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有多種關(guān)鍵性生理功能，以γ分泌酶為靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的AD治療藥物風(fēng)險(xiǎn)較大。同樣的，BACE1除了具有APP做為底物外還具有其它各種底物分子，單純的抑制BACE1活性也會(huì)妨礙其它底物正常的生理功能，從

3、而引起毒副作用。
　　 本研究以含有APP上BACE1酶切位點(diǎn)和Aβ N端的多肽為抗原，利用人源性單鏈抗體庫，首次在國際上篩選出了能夠同時(shí)特異結(jié)合BACE1酶切位點(diǎn)和Aβ的單鏈可變區(qū)抗體(single chain variable fragment，scFv)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，篩選所得的10株scFv能夠特異結(jié)合APP上BACE1酶切位點(diǎn)和Aβ多肽；對(duì)其中兩株抗體進(jìn)行Western Blot表明篩選得到的scFv與含有BACE1酶

4、切位點(diǎn)和Aβ N端的多肽呈現(xiàn)抗原-抗體反應(yīng)；SPR法測(cè)定兩株scFv與BACE1酶切位點(diǎn)的親和力常數(shù)分別為5.06×10-6mol/L和4.83×10-8mol/L；ELISA、Dot-Blot表明篩選得到的scFv能夠與Aβ40和Aβ42的單體、寡聚體和纖維狀聚合物均特異性結(jié)合，結(jié)合量與scFv濃度正相關(guān)；熒光能量共振轉(zhuǎn)移、熒光素ThT和MTT實(shí)驗(yàn)表明，篩選得到的scFv能夠抑制BACE1對(duì)其底物的酶切作用，并且能夠抑制Aβ的聚集及A