特異結(jié)合乙肝e抗原的核酸適體的篩選及其檢測應(yīng)用.pdf

1、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是引起病毒性肝炎的主要病原體之一，乙肝在全世界范圍內(nèi)廣泛流行，經(jīng)粗略估計，全世界約30％的人口血清學(xué)檢測顯示其曾經(jīng)或仍然處于乙肝病毒感染狀態(tài)。而在所有的肝癌患者中，半數(shù)是由于乙肝病毒感染所致。鑒于此，全球衛(wèi)生組織已將病毒性肝炎囊括進(jìn)了重大公共衛(wèi)生優(yōu)先項目中。具有臨床意義的乙肝病毒蛋白主要包括乙肝核心抗原，乙肝e抗原和乙肝c抗原，其中乙肝e抗原(hepatitis B virus

2、e antigen，HBeAg)是乙肝病毒內(nèi)核的主要結(jié)構(gòu)蛋白，血清中的HBeAg是一種病毒標(biāo)志物，是乙肝病毒在人體內(nèi)復(fù)制過程中的一個主要產(chǎn)物，該抗原不僅在臨床上被用作為判斷HBV活動性復(fù)制的指標(biāo)之一，還在慢性乙肝的最基本治療，即抗病毒治療中發(fā)揮中重要的指導(dǎo)作用，更有研究顯示，HBeAg在母嬰傳播中也起著重要。但是傳統(tǒng)的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)法檢測HBeAg存在靈敏度低，假陽性，重復(fù)性差等缺點。核酸適體是一段經(jīng)體外篩選得到的單鏈D

3、NA或RNA，由于其特殊的理化性質(zhì)，目前能用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行診斷的技術(shù)幾乎都可以用適體替代。本文以特異性檢測HBeAg為目標(biāo)，圍繞核酸適體進(jìn)行了篩選、結(jié)合熒光和金納米優(yōu)化檢測條件的一系列實驗。
　　本文的主要研究內(nèi)容如下:
　　1) HBeAg特異性DNA適體的篩選和分析:利用體外配體指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化(SELEX)技術(shù)對特異性結(jié)合HBeAg蛋白的DNA適體進(jìn)行篩選，采用牛血清蛋白進(jìn)行陰性篩選以提高篩選效率，利用磁分離對結(jié)合H

4、BeAg蛋白的適體和未結(jié)合的游離核酸進(jìn)行分離，采用不對稱PCR擴增的方法得到單一的ssDNA，對篩選得到的產(chǎn)物進(jìn)行克隆測序，并將測序所得的適體除去上下游引物后進(jìn)行和首輪ssDNA文庫對比的親和性檢測，最后進(jìn)行二級結(jié)構(gòu)分析。（第二章內(nèi)容）
　　2)核酸適體熒光法檢測HBeAg:將親和性最高的組別作為最終適體，以HBeAg適體與其互補的核酸形成雜交雙鏈和其特異性結(jié)合HBeAg蛋白的能力為基礎(chǔ)，通過在HBeAg適體上修飾熒光基團FAM，