腺病毒主要晚期轉(zhuǎn)錄單位上URE調(diào)控元件結(jié)合蛋白的篩選及其初步功能研究.pdf

1、腺病毒在宿主細胞中的生活周期以病毒DNA復制的起始為界限被分為早期感染階段和晚期感染階段。早期基因編碼病毒的調(diào)控蛋白，晚期基因主要編碼結(jié)構(gòu)蛋白，早晚期階段基因的表達是一個受到各個水平嚴密調(diào)控的過程。腺病毒的主要晚期轉(zhuǎn)錄單位(Majorlatetranscriptionunit，MLTU)上有5個polyA信號而將其分為L1到L55個轉(zhuǎn)錄區(qū)。腺病毒生活周期中，MLTU上5個轉(zhuǎn)錄區(qū)的使用存在一個顯著的時間變化：早期階段MLTU轉(zhuǎn)錄水平比較低

2、，并且主要只利用了MLTU上L1一個轉(zhuǎn)錄區(qū)，L1編碼和病毒包裝有關的非結(jié)構(gòu)蛋白；而在晚期階段MLTU轉(zhuǎn)錄水平升高，并且腺病毒利用了MLTU上所有5個轉(zhuǎn)錄區(qū)，并且腺病毒大部分晚期蛋白尤其是病毒結(jié)構(gòu)蛋白都從這5個轉(zhuǎn)錄區(qū)轉(zhuǎn)錄表達出。所以，在腺病毒早晚期感染階段轉(zhuǎn)換的調(diào)控中，有一個重要問題就是：腺病毒如何在不同的感染階段使用MLTU上不同的轉(zhuǎn)錄區(qū)?即MLTU上不同polyA位點使用轉(zhuǎn)換的機制。 研究發(fā)現(xiàn)L1polyA位點上游存在一個上游

3、調(diào)控元件(upstreamregulatoryelement，URE)，在早期感染階段，URE能夠使轉(zhuǎn)錄出的包含URE的L2、L3轉(zhuǎn)錄本在核內(nèi)不穩(wěn)定，不能有效進入胞漿成熟mRNA庫，從而抑制L2、L3的基因表達，使L1成為早期階段主導使用的轉(zhuǎn)錄本。本實驗室利用HeLa細胞核液與URERNA的紫外交聯(lián)的實驗發(fā)現(xiàn)，URE可同至少兩個30kd左右的蛋白結(jié)合。為進一步研究URE在異源polyA信號上游時抑制基因表達的機制，本課題采用酵母三雜交的

4、方法篩選HeLacDNA文庫，尋找URE結(jié)合蛋白，并對候選的RNA結(jié)合蛋白后進行功能研究，發(fā)現(xiàn)該蛋白參與URE抑制基因表達的機制，為研究腺病毒早晚期轉(zhuǎn)換調(diào)控的機制和細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控提供新的依據(jù)。 酵母三雜交系統(tǒng)由三部分組成：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白、雜交RNA分子、DNA激活結(jié)構(gòu)域融合蛋白。在利用cDNA文庫篩選URERNA結(jié)合蛋白時，URE分子是“誘餌”，融合有DNA激活結(jié)構(gòu)域的cDNA文庫質(zhì)粒是“誘餌”要尋找的“獵物

5、”。 我們首先測定了預制HeLacDNA文庫的滴度，克隆擴增了文庫的3×107個克隆，為文庫原始容量的10倍，有效保證擴增后的文庫的完整性。然后，通過對URE序列的堿基分析，發(fā)現(xiàn)URE上有RNA聚合酶Ⅲ的終止子，所以選擇下游的MD功能片段作為三雜交中的“誘餌”序列。我們還使用了RNAstructure軟件對MD序列的兩種“誘餌”RNA分子進行了二級結(jié)構(gòu)的分析。預測的兩種“誘餌”RNA分子在最低自由能下的二級結(jié)構(gòu)顯示，leader

6、-MD-MS2序列沒有穩(wěn)定的異源序列間的配對，各部分能夠保持結(jié)構(gòu)的相對獨立性。根據(jù)二級結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果構(gòu)建了相應的“誘餌”質(zhì)粒pRH3'-MD。擴增的cDNA文庫和構(gòu)建的“誘餌”質(zhì)粒pRH3'-MD為酵母三雜交實驗奠定了基礎。 我們采用順序轉(zhuǎn)化法，分別將DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域質(zhì)粒、“誘餌”質(zhì)粒和文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母菌中，在相應選擇性培養(yǎng)基上生長，利用酵母三雜交篩選cDNA文庫。根據(jù)計算共篩選到6×106個轉(zhuǎn)化子，有效覆蓋文庫的原始容量。根據(jù)

7、篩選到的His和LacZ陽性克隆，并嚴格根據(jù)二次轉(zhuǎn)化的質(zhì)量控制，得到有效測序結(jié)果13個。通過NCBI上的blastn序列比對，鑒定各個序列對應的蛋白產(chǎn)物；結(jié)合文獻檢索，通過分析陽性克隆的分子量大小、克隆出現(xiàn)頻率、蛋白定位和已知功能等，確定了候選MDRNA結(jié)合蛋白Hax1。 確定Hax1為候選RNA結(jié)合蛋白后，我們首先通過改進的酵母三雜交實驗，進一步確定Hax1蛋白結(jié)合MDRNA的依賴性和特異性；然后利用RT-PCR等方法克隆Ha

8、x1，構(gòu)建真核表達載體pCVM-myc-Hax1，并驗證了其在真核細胞中的表達。同時我們將URE置于熒光素酶報告基因的SV40polyA位點上游，構(gòu)建了pGL3-promoter-URE載體，發(fā)現(xiàn)插入的URE元件可使報告基因表達水平顯著降低，URE發(fā)揮了在異源polyA上游時抑制基因表達的作用。將pGL3-promoter-URE作為研究URE抑制基因表達的模型，把pGL3-promoter-URE和pCVM-myc-Hax1不同比例共