腺病毒主要晚期轉(zhuǎn)錄單位上URE調(diào)控元件結(jié)合蛋白的篩選及其初步功能研究.pdf

1、腺病毒在宿主細(xì)胞中的生活周期以病毒DNA復(fù)制的起始為界限被分為早期感染階段和晚期感染階段。早期基因編碼病毒的調(diào)控蛋白，晚期基因主要編碼結(jié)構(gòu)蛋白，早晚期階段基因的表達(dá)是一個(gè)受到各個(gè)水平嚴(yán)密調(diào)控的過程。腺病毒的主要晚期轉(zhuǎn)錄單位(Majorlatetranscriptionunit，MLTU)上有5個(gè)polyA信號(hào)而將其分為L(zhǎng)1到L55個(gè)轉(zhuǎn)錄區(qū)。腺病毒生活周期中，MLTU上5個(gè)轉(zhuǎn)錄區(qū)的使用存在一個(gè)顯著的時(shí)間變化：早期階段MLTU轉(zhuǎn)錄水平比較低

2、，并且主要只利用了MLTU上L1一個(gè)轉(zhuǎn)錄區(qū)，L1編碼和病毒包裝有關(guān)的非結(jié)構(gòu)蛋白；而在晚期階段MLTU轉(zhuǎn)錄水平升高，并且腺病毒利用了MLTU上所有5個(gè)轉(zhuǎn)錄區(qū)，并且腺病毒大部分晚期蛋白尤其是病毒結(jié)構(gòu)蛋白都從這5個(gè)轉(zhuǎn)錄區(qū)轉(zhuǎn)錄表達(dá)出。所以，在腺病毒早晚期感染階段轉(zhuǎn)換的調(diào)控中，有一個(gè)重要問題就是：腺病毒如何在不同的感染階段使用MLTU上不同的轉(zhuǎn)錄區(qū)?即MLTU上不同polyA位點(diǎn)使用轉(zhuǎn)換的機(jī)制。 研究發(fā)現(xiàn)L1polyA位點(diǎn)上游存在一個(gè)上游

3、調(diào)控元件(upstreamregulatoryelement，URE)，在早期感染階段，URE能夠使轉(zhuǎn)錄出的包含URE的L2、L3轉(zhuǎn)錄本在核內(nèi)不穩(wěn)定，不能有效進(jìn)入胞漿成熟mRNA庫(kù)，從而抑制L2、L3的基因表達(dá)，使L1成為早期階段主導(dǎo)使用的轉(zhuǎn)錄本。本實(shí)驗(yàn)室利用HeLa細(xì)胞核液與URERNA的紫外交聯(lián)的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，URE可同至少兩個(gè)30kd左右的蛋白結(jié)合。為進(jìn)一步研究URE在異源polyA信號(hào)上游時(shí)抑制基因表達(dá)的機(jī)制，本課題采用酵母三雜交的

4、方法篩選HeLacDNA文庫(kù)，尋找URE結(jié)合蛋白，并對(duì)候選的RNA結(jié)合蛋白后進(jìn)行功能研究，發(fā)現(xiàn)該蛋白參與URE抑制基因表達(dá)的機(jī)制，為研究腺病毒早晚期轉(zhuǎn)換調(diào)控的機(jī)制和細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控提供新的依據(jù)。 酵母三雜交系統(tǒng)由三部分組成：DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域融合蛋白、雜交RNA分子、DNA激活結(jié)構(gòu)域融合蛋白。在利用cDNA文庫(kù)篩選URERNA結(jié)合蛋白時(shí)，URE分子是“誘餌”，融合有DNA激活結(jié)構(gòu)域的cDNA文庫(kù)質(zhì)粒是“誘餌”要尋找的“獵物

5、”。 我們首先測(cè)定了預(yù)制HeLacDNA文庫(kù)的滴度，克隆擴(kuò)增了文庫(kù)的3×107個(gè)克隆，為文庫(kù)原始容量的10倍，有效保證擴(kuò)增后的文庫(kù)的完整性。然后，通過對(duì)URE序列的堿基分析，發(fā)現(xiàn)URE上有RNA聚合酶Ⅲ的終止子，所以選擇下游的MD功能片段作為三雜交中的“誘餌”序列。我們還使用了RNAstructure軟件對(duì)MD序列的兩種“誘餌”RNA分子進(jìn)行了二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析。預(yù)測(cè)的兩種“誘餌”RNA分子在最低自由能下的二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，leader

6、-MD-MS2序列沒有穩(wěn)定的異源序列間的配對(duì)，各部分能夠保持結(jié)構(gòu)的相對(duì)獨(dú)立性。根據(jù)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果構(gòu)建了相應(yīng)的“誘餌”質(zhì)粒pRH3'-MD。擴(kuò)增的cDNA文庫(kù)和構(gòu)建的“誘餌”質(zhì)粒pRH3'-MD為酵母三雜交實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。 我們采用順序轉(zhuǎn)化法，分別將DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域質(zhì)粒、“誘餌”質(zhì)粒和文庫(kù)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母菌中，在相應(yīng)選擇性培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，利用酵母三雜交篩選cDNA文庫(kù)。根據(jù)計(jì)算共篩選到6×106個(gè)轉(zhuǎn)化子，有效覆蓋文庫(kù)的原始容量。根據(jù)

7、篩選到的His和LacZ陽性克隆，并嚴(yán)格根據(jù)二次轉(zhuǎn)化的質(zhì)量控制，得到有效測(cè)序結(jié)果13個(gè)。通過NCBI上的blastn序列比對(duì)，鑒定各個(gè)序列對(duì)應(yīng)的蛋白產(chǎn)物；結(jié)合文獻(xiàn)檢索，通過分析陽性克隆的分子量大小、克隆出現(xiàn)頻率、蛋白定位和已知功能等，確定了候選MDRNA結(jié)合蛋白Hax1。 確定Hax1為候選RNA結(jié)合蛋白后，我們首先通過改進(jìn)的酵母三雜交實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步確定Hax1蛋白結(jié)合MDRNA的依賴性和特異性；然后利用RT-PCR等方法克隆Ha

8、x1，構(gòu)建真核表達(dá)載體pCVM-myc-Hax1，并驗(yàn)證了其在真核細(xì)胞中的表達(dá)。同時(shí)我們將URE置于熒光素酶報(bào)告基因的SV40polyA位點(diǎn)上游，構(gòu)建了pGL3-promoter-URE載體，發(fā)現(xiàn)插入的URE元件可使報(bào)告基因表達(dá)水平顯著降低，URE發(fā)揮了在異源polyA上游時(shí)抑制基因表達(dá)的作用。將pGL3-promoter-URE作為研究URE抑制基因表達(dá)的模型，把pGL3-promoter-URE和pCVM-myc-Hax1不同比例共