RNAi靶向BACE1基因治療阿爾茨海默病的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?本研究在前期對(duì)AD多年研究的基礎(chǔ)之上，采用新的基因表達(dá)抑制工具——RNA干擾技術(shù)(RNAinterference，RNAi)技術(shù)，探討RNAi技術(shù)在體外細(xì)胞特異性下調(diào)BACE1的效果，為利用RNAi技術(shù)靶向BACE1治療AD研究的進(jìn)一步開(kāi)展提供重要資料。 材料與方法 1.采用體外轉(zhuǎn)錄法合成siRNA用于RNAi實(shí)驗(yàn)。體外轉(zhuǎn)錄的基本步驟是：設(shè)計(jì)合成T7啟動(dòng)子(18bp)及含目標(biāo)基因和T7啟動(dòng)子反向互補(bǔ)序列

2、的DNA寡核苷酸鏈，兩者退火后形成雙鏈DNA。然后，T7RNA聚合酶在T7啟動(dòng)子引導(dǎo)下，以目標(biāo)基因DNA寡核苷酸鏈為模板轉(zhuǎn)錄生成單鏈RNA。用DNase-Ⅰ降解反應(yīng)體系中的DNA，獲得單鏈RNA。將兩個(gè)反應(yīng)體系中生成的正、負(fù)單鏈RNA退火獲得siRNA。 2.以neuro-2a小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，將外源GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)neuro-2a細(xì)胞，采用不同siRNA劑量對(duì)其進(jìn)行干擾。neuro-2a細(xì)胞是一種與原代神經(jīng)元特性相似

3、的細(xì)胞，更適合用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。實(shí)驗(yàn)設(shè)立了空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、不同劑量siGFP轉(zhuǎn)染組(分別為50ng、150ng、250ng)、非特異性對(duì)照組，轉(zhuǎn)染后在熒光顯微鏡下觀察不同實(shí)驗(yàn)組GFP的表達(dá)情況。通過(guò)觀察GFP的表達(dá)與抑制情況檢測(cè)合成體外轉(zhuǎn)錄合成siRNA的有效性和特異性，并對(duì)neuro-2a細(xì)胞的轉(zhuǎn)染特性進(jìn)行評(píng)估，指導(dǎo)對(duì)轉(zhuǎn)染體系進(jìn)行優(yōu)化。 3.采用體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNA對(duì)neuro-2a細(xì)胞內(nèi)源BACE1基因進(jìn)行

4、干擾。干擾分別從三個(gè)不同的位點(diǎn)進(jìn)行，于干擾后24h、48h、72h提取細(xì)胞總RNA，采用realtime-PCR檢測(cè)不同干擾位點(diǎn)BACE1mRNA的表達(dá)水平。 4.采用AmaxaNucleofectorTM技術(shù)對(duì)原代培養(yǎng)的皮質(zhì)神經(jīng)元進(jìn)行轉(zhuǎn)染，將外源GFP表達(dá)質(zhì)粒和干擾GFP的siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)原代皮質(zhì)神經(jīng)元，成功探索出一種可有效轉(zhuǎn)染原代神經(jīng)元的方法。 結(jié)果 1.通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄法合成出有效的siRNA。 2.外

5、源GFP質(zhì)?？杀挥行У霓D(zhuǎn)染進(jìn)neuro-2a內(nèi)，并有效表達(dá)。GFP在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)呈現(xiàn)一定的時(shí)效性，隨轉(zhuǎn)染后時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)先逐漸增強(qiáng)然后又逐漸減弱的趨勢(shì)，48h～60h時(shí)是觀察熒光的較好時(shí)機(jī)。體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNA可以有效的敲低GFP基因的表達(dá)，敲低的程度與siRNA的劑量有關(guān)。 3.體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNA有效的抑制了neuro-2a細(xì)胞內(nèi)源BACE1基因的表達(dá)。siRNA對(duì)BACE1的抑制效應(yīng)與靶位點(diǎn)的選擇及檢測(cè)的時(shí)間有關(guān)，

6、不同的干擾位點(diǎn)其抑制效果不同；干擾后選擇不同的檢測(cè)時(shí)間，檢測(cè)到的RNAi抑制效果也不相同。 4.在AmaxaNucleofectorTM轉(zhuǎn)染技術(shù)和轉(zhuǎn)染體系下，原代神經(jīng)元可以被有效轉(zhuǎn)染并表現(xiàn)出明顯的目的基因干擾現(xiàn)象，而且沒(méi)有明顯的神經(jīng)毒性反應(yīng) 結(jié)論 1.采用T7RNA聚合酶催化體外轉(zhuǎn)錄法合成siRNA。體外轉(zhuǎn)錄法是一種操作簡(jiǎn)單、成本低、效率高的siRNA的合成方法，本課題組在前人的研究之上，對(duì)此方法進(jìn)行了改進(jìn)，增加

7、了siRNA的提純步驟，祛出了大部分反應(yīng)體系中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，得到高純度的siRNA，確保了進(jìn)行RNA干擾研究對(duì)細(xì)胞或機(jī)體對(duì)導(dǎo)入siRNA的質(zhì)量要求。這為大范圍、高通量進(jìn)行RNA干擾研究提供了一種理想的siRNA合成方法。 2.利用體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNA，成功抑制了neuro-2a小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞株外源GFP基因的表達(dá)。將外源GFP基因轉(zhuǎn)染至體外培養(yǎng)的neuro-2a中并使其表達(dá)，同時(shí)將不同濃度的siGFP共同轉(zhuǎn)染至neuro-

8、2a中，并以siIRR做參照。GFP基因在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)隨轉(zhuǎn)染后時(shí)間的增長(zhǎng)呈現(xiàn)出一個(gè)先逐漸增高然后又逐漸降低的過(guò)程，GFP表達(dá)最強(qiáng)的時(shí)點(diǎn)為觀察RNAi效果的最佳時(shí)刻。對(duì)GFP干擾的分析發(fā)現(xiàn)，siRNA不僅能特異、有效地降低外源目標(biāo)基因的表達(dá)，而且隨著siRNA量的增加，其干擾效果越來(lái)越明顯。 3.利用體外轉(zhuǎn)錄合成的siRNA，成功抑制了neuro-2a小鼠神經(jīng)瘤細(xì)胞株內(nèi)源BACE1基因的表達(dá)，這種抑制作用呈現(xiàn)出位點(diǎn)效應(yīng)和時(shí)間效應(yīng)。

9、不同的干擾位點(diǎn)，其干擾效果會(huì)有不同；另外，siRNA在細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮靶基因mRNA降解作用需要一定的時(shí)間，這主要與siRNA在細(xì)胞內(nèi)形成RISC的時(shí)間及靶基因mRNA的代謝特性有關(guān)。此外，若一次轉(zhuǎn)染后若停止繼續(xù)添加siRNA，被敲低的靶基因mRNA水平還可逐漸恢復(fù)正常，因此，轉(zhuǎn)染后選擇合適的分析時(shí)間至關(guān)重要，過(guò)早或過(guò)晚分析都會(huì)影響對(duì)RNAi效果的準(zhǔn)確評(píng)價(jià)。 4.探索出一套可有效轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)皮質(zhì)神經(jīng)元的方法。經(jīng)過(guò)一系列實(shí)驗(yàn)探索，發(fā)現(xiàn)通