宮內(nèi)移植Raav-BDNF對(duì)抑制胚胎期顯性脊柱裂胎鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的實(shí)驗(yàn)性研究.pdf

1、目的：
　　 神經(jīng)管畸形(neural tube defects,NTDs)是小兒常見的先天畸形,其主要包括脊柱裂、露腦畸形,顱裂,腦積水等,其中以脊椎裂最為常見,約占全部畸形的95%左右。目前認(rèn)為神經(jīng)管畸形的發(fā)生是遺傳和環(huán)境因素共同作用的結(jié)果。在胚胎發(fā)育過程中細(xì)胞凋亡現(xiàn)象普遍存在,這對(duì)于多細(xì)胞生物的組織形成和形體構(gòu)建具有重要意義。細(xì)胞凋亡和增殖貫穿于胚胎發(fā)育過程中的整個(gè)階段,并且是由一系列相關(guān)基因所控制的。任何原因?qū)е碌牡蛲鍪?/p>

2、衡都能干擾整個(gè)機(jī)體器官的正常發(fā)育及其形態(tài)的構(gòu)成。許多資料顯示NTDs與細(xì)胞凋亡有關(guān)。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(Brain derived neurotrophic factor,BDNF)是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族成員之一,它是由靶細(xì)胞合成并分泌,經(jīng)神經(jīng)突起逆行轉(zhuǎn)運(yùn)至神經(jīng)元胞體并且主要與其高親和力受體酪氨酸激酶B(TrkB)結(jié)合而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,并可維持胚胎發(fā)育中神經(jīng)元的存活、促進(jìn)其分化與增殖,誘導(dǎo)其軸突生長以及調(diào)控成熟神經(jīng)元的生理功能和促進(jìn)損傷神

3、經(jīng)元的修復(fù)?；蛑委熥鳛橐环N全新的治療疾病的方式興起于20世紀(jì)80年代,其具體操作是通過基因載體將有治療作用的基因?qū)氚屑?xì)胞,使其過表達(dá)目的蛋白,從而糾正由于先天基因缺陷而導(dǎo)致的蛋白分泌不足,從而達(dá)到治愈疾病的目的。因此我們利用基因療法將帶有BDNF基因的重組腺相關(guān)病毒載體(Recombin antadeno-associated virus,rAAV)轉(zhuǎn)染到先天性顯性脊椎裂胎鼠體內(nèi)進(jìn)行治療,觀察rAAV介導(dǎo)的BDNF對(duì)先天性脊椎裂中神

4、經(jīng)細(xì)胞凋亡的抑制作用,為先天性脊椎裂治療提供新思路。
　　 方法：
　　 1、雌雄Wistar大鼠按5:1合籠,次日晨陰道涂片,發(fā)現(xiàn)精子者視為孕0天(EO)。
　　 2、Wistar大鼠在E10給維甲酸制作動(dòng)物模型:將維甲酸溶于橄欖油中(40mg/ml),以劑量為150mg/ml經(jīng)胃管注入胃內(nèi)給藥。
　　 3、將E16孕鼠隨機(jī)分為rAAV-BDNF治療組,rAAV-ZsGreen對(duì)照組,正常對(duì)照組。治療組

5、和對(duì)照組均在大鼠E16利用胎仔外科的方法利用微量注射器在手術(shù)顯微鏡下將帶有目的基因和不帶目的基因的病毒載體分別注射到顯性脊柱裂胎鼠腰骶部。正常對(duì)照組為未給藥致畸組,其不做任何處理。
　　 4、于E20無菌條件下打開孕鼠子宮,治療組和對(duì)照組分別找到轉(zhuǎn)基因治療的胎鼠:正常對(duì)照組隨機(jī)取活胎即可。將取出的胎鼠直視下心內(nèi)灌注4%多聚甲醛進(jìn)行固定,待胎鼠組織固定好后于胎鼠上肢水平截?cái)嗉顾柚糜?%多聚甲醛中繼續(xù)浸泡固定24小時(shí)。然后置于20%

6、蔗糖溶液中脫水24小時(shí),之后將標(biāo)本取出置于-80℃。
　　 5、冰凍切片后利用TUNEL試劑盒檢測三組細(xì)胞凋亡情況;免疫熒光觀察三組BDNF的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、本實(shí)驗(yàn)利用Wistar孕鼠共44只,術(shù)后成活28只,成活率為63.64%。治療組和空載體治療組各9只孕鼠,其中治療組轉(zhuǎn)染胎鼠30只,得到顯性脊柱裂脊髓21個(gè),胎鼠的存活率為70.00%,得到病毒載體成功轉(zhuǎn)染神經(jīng)組織的顯性脊柱裂脊髓9個(gè);空

7、載體治療組轉(zhuǎn)染胎鼠28只,得到顯性脊柱裂脊髓20個(gè),胎鼠的存活率為71.43%,得到病毒載體成功轉(zhuǎn)染神經(jīng)組織的顯性脊柱裂脊髓9個(gè),兩組比較經(jīng)卡方檢驗(yàn),P＞0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明帶有目的基因的病毒載體和不帶目的基因的病毒載體對(duì)胎鼠的成活率無明顯影響。正常對(duì)照組為10只孕鼠,隨機(jī)取胎鼠為10只,得到正常胎鼠脊髓10個(gè)。
　　 2、本實(shí)驗(yàn)利用免疫熒光法對(duì)治療組、空載體治療組及正常組進(jìn)行染色測定3DNF的表達(dá),結(jié)果可見治療組紅

8、色熒光的強(qiáng)度明顯較空載體治療組和正常組強(qiáng)。
　　 3、本實(shí)驗(yàn)利用TUNEL染色試劑盒對(duì)大鼠脊髓切片進(jìn)行染色,測定其凋亡細(xì)胞數(shù)量,通過激光共聚焦顯微鏡成像比較可見治療組的凋亡情況明顯較空載體治療疆和正常組減輕。治療組平均每個(gè)脊髓切片的凋亡細(xì)胞數(shù)為5±3個(gè),空載體治療組平均每個(gè)截面的凋亡細(xì)胞數(shù)為20±6個(gè),正常對(duì)照組每個(gè)截面的凋亡細(xì)胞數(shù)為11±6個(gè)。經(jīng)t檢驗(yàn),治療組和空載體治療組P＜0.05;治療組和正常組P＜0.05:空載體治療組