胎鼠神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)及移植治療Tourette綜合征大鼠實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究背景 Tourette綜合征(Tourette syndrome，TS)是兒童期最常見的精神運(yùn)動(dòng)障礙之一，表現(xiàn)為多發(fā)的運(yùn)動(dòng)性抽動(dòng)和發(fā)聲性抽動(dòng)，近年來患病率有增加趨勢(shì)。抽動(dòng)是指刻板的、不隨意的、無目的地重復(fù)性動(dòng)作，該癥狀在整個(gè)TS的自然病程中可以持續(xù)多年，發(fā)作頻率和強(qiáng)度不時(shí)地發(fā)生變化。TS伴發(fā)的行為癥狀復(fù)雜多樣，如注意缺陷多動(dòng)障礙、強(qiáng)迫障礙、自傷行為以及情緒障礙等，不同程度地干擾兒童的認(rèn)知功能和發(fā)育，影響社會(huì)適應(yīng)能力。多數(shù)情況

2、下，抽動(dòng)具有自限性，并可以通過行為矯正或藥物治療得到控制。盡管TS是一種良性的神經(jīng)精神障礙，仍有接近半數(shù)的患者癥狀遷延，治療困難，甚至延續(xù)到成人，導(dǎo)致終身疾患，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量。對(duì)一部分患者而言，抽動(dòng)可導(dǎo)致終生的損害，約有5％的TS患者其癥狀是危及生命的，可稱之為惡性TS。多種藥物對(duì)惡性TS的治療效果欠佳，因此近年來人們逐漸開始嘗試用神經(jīng)外科手術(shù)方法治療惡性TS。深部腦刺激(deep brain stimulation，DBS)療法對(duì)嚴(yán)

3、重的難治性抽動(dòng)癥具有一定療效，但昂貴的治療費(fèi)用以及某些手術(shù)并發(fā)癥限制了DBS的應(yīng)用。近年來在TS的治療方面未見有重大的突破性進(jìn)展，TS的治療問題仍是本領(lǐng)域研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，因此，我們?cè)噲D找出一條不同于傳統(tǒng)對(duì)癥治療方法的途徑，即從細(xì)胞水平進(jìn)行治療，盡可能從根本上替代和修復(fù)結(jié)構(gòu)和功能受損傷的神經(jīng)細(xì)胞，以期獲得更好的治療效果，探尋治療TS，尤其是惡性難治性抽動(dòng)癥的新方法。 近年來，干細(xì)胞移植治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的潛能引起人們極大的興趣

4、。神經(jīng)干細(xì)胞(Neural stem cells，NSCs)是一種能夠自我更新具有多種分化潛能的未成熟的前體細(xì)胞。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，將神經(jīng)干細(xì)胞注入動(dòng)物腦內(nèi)或血液內(nèi)以后，細(xì)胞可以存活并遷移到受損傷的部位，整合到神經(jīng)回路中，使動(dòng)物的神經(jīng)功能得到改善。神經(jīng)干細(xì)胞移植為許多難以治療的神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了新的治療途徑，開拓了中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病治療的新視野，在生命科學(xué)研究領(lǐng)域中倍受重視。神經(jīng)干細(xì)胞移植將成為多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙及損傷后最有前途的神經(jīng)組

5、織替代性治療策略。與傳統(tǒng)的藥物治療相比，干細(xì)胞移植療法具有其自身獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，尤其適用于某些發(fā)病機(jī)制不清的神經(jīng)系統(tǒng)疾病。關(guān)于TS的確切的發(fā)病機(jī)制，無論在分子水平還是細(xì)胞水平，至今仍然不是很清楚。神經(jīng)影像學(xué)、神經(jīng)生理學(xué)及尸檢研究表明，TS是一種以基底神經(jīng)節(jié)病變?yōu)榛A(chǔ)的運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)和調(diào)節(jié)障礙，病變部位有可能涉及皮質(zhì)-紋狀體-丘腦-皮質(zhì)環(huán)路中的任一部分。綜上所述，我們推測(cè)如果將神經(jīng)干細(xì)胞移植到TS病變部位，這些細(xì)胞有可能代替中樞神經(jīng)系統(tǒng)中功能低下或

6、受損的細(xì)胞發(fā)揮作用，重獲內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，從而減少刻板行為發(fā)作的頻率及強(qiáng)度。關(guān)于神經(jīng)干細(xì)胞治療TS的研究還是空白，目前國(guó)內(nèi)外尚未見到有關(guān)這方面研究的論文報(bào)道。因此，本研究試圖考察神經(jīng)干細(xì)胞移植能否改善TS大鼠的腦功能并減少其刻板行為，并對(duì)細(xì)胞移植治療的作用機(jī)制進(jìn)行初步地探討。 目的： 探討胚胎大鼠大腦紋狀體神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、標(biāo)記與鑒定方法，觀察神經(jīng)干細(xì)胞增殖、傳代和分化的規(guī)律；建立大鼠TS模型，采用立體定向腦內(nèi)注射法，

7、將神經(jīng)干細(xì)胞移植到大鼠紋狀體內(nèi)，觀察神經(jīng)干細(xì)胞原位移植后移植細(xì)胞的成活、分化以及大鼠刻板行為改善情況。 方法： 1、神經(jīng)干細(xì)胞的取材、分離、培養(yǎng)和鑒定本實(shí)驗(yàn)在無菌條件下取100只E13胚胎大鼠腦紋狀體組織，解剖顯微鏡下用銳性刀片切割腦組織，吸管反復(fù)吹打機(jī)械分離制備單細(xì)胞懸液。調(diào)節(jié)單細(xì)胞懸液濃度，用DMEM/F12培養(yǎng)液調(diào)節(jié)稀釋至細(xì)胞密度為5×105個(gè)/ml，接種到含有EGF(20ng/ml)和bFGF(20ng/ml)的

8、DMEM/F12無血清培養(yǎng)基中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況每2～3天半量換液，低速離心未貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞克隆，用新鮮培養(yǎng)液更換半量液體，吹打分散成單細(xì)胞及小細(xì)胞團(tuán)，繼續(xù)培養(yǎng)。原代培養(yǎng)5～6天后，形成數(shù)目較多、個(gè)體較大約含幾十個(gè)甚至上百個(gè)細(xì)胞的“神經(jīng)球"，采用機(jī)械吹打與胰蛋白酶消化相結(jié)合的方法及時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。收集細(xì)胞，離心后棄上清液，加入1ml0.25％胰蛋白酶，同時(shí)用吸管反復(fù)輕柔吹打細(xì)胞懸液，避免產(chǎn)生氣泡，將“

9、神經(jīng)球”重新分散制成單細(xì)胞懸液，當(dāng)消化液略呈乳狀時(shí)加入等體積的含10％胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化，調(diào)節(jié)細(xì)胞接種密度分瓶傳代培養(yǎng)。分別用抗Nestin抗體、抗MAP2抗體、抗GFAP抗體，對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行干細(xì)胞特性和多分化潛能的免疫組織化學(xué)鑒定。取3～4代神經(jīng)干細(xì)胞用于移植，移植前24小時(shí)將BrdU(10μg/ml)加入培養(yǎng)基中對(duì)細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。 2、TS大鼠動(dòng)物模型的建立與神經(jīng)干細(xì)胞移植抽取TS患者靜脈血2.5ml，離心后分

10、離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzymelinked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)患者血清中的抗神經(jīng)抗體滴度。從TS患者中選取8例OD值最高的患者血清用于大鼠紋狀體微量灌注，以建立TS大鼠動(dòng)物模型。32只wistar大鼠被隨機(jī)分為4組，每組8只：假模型組(微量注射正常兒童血清)，TS組(微量注射TS患者血清)，TS+PBS組(紋狀體內(nèi)被微量注射TS患者血清后再給予PBS做治療對(duì)照)，TS+NSCs移植組(紋

11、狀體內(nèi)被微量注射TS患者血清后再進(jìn)行NSC腦內(nèi)移植治療)。將大鼠麻醉后固定于立體定向儀上，無菌條件下將套管置入大鼠雙側(cè)紋狀體內(nèi)，套管置入位點(diǎn)為前囟前2.0mm、正中線左右4.0mm、顱下7.0mm。1周后通過微量滲透泵將血清以0.5μl/h的速度緩慢注入大鼠紋狀體內(nèi)，持續(xù)灌注72小時(shí)。血清灌注結(jié)束后，進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞移植，在損傷位點(diǎn)原位注射神經(jīng)干細(xì)胞懸液，每個(gè)注射位點(diǎn)接受2μl的細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為5×105個(gè)/μl。在移植后1天，7天，

12、14天和21天評(píng)估大鼠刻板動(dòng)作行為，在每12小時(shí)光循環(huán)結(jié)束前的最后30分鐘觀察大鼠的動(dòng)作行為如嚙咬(用牙齒咬籠子，嚼木屑，無目的咀嚼)、將前爪舉到嘴邊或面部、舔(不包括理毛)、理毛行為、搖頭、搖動(dòng)爪子、用后腿站立及階段性的發(fā)聲，將所觀察到的動(dòng)作行為計(jì)數(shù)的總和作為評(píng)估刻板運(yùn)動(dòng)的總分。 3、神經(jīng)干細(xì)胞腦內(nèi)移植后的存活和分化神經(jīng)干細(xì)胞移植后3周，處死大鼠，進(jìn)行心臟灌流固定?？焖俟嘧BS150～200ml，沖洗脈管系統(tǒng)，隨后換用4℃的

13、4％多聚甲醛溶液繼續(xù)灌注。灌流結(jié)束后將大鼠斷頭取腦，尋找雙側(cè)腦表面的標(biāo)志針孔，以針孔為中心切取標(biāo)志針孔周圍腦組織；將腦組織浸入4％多聚甲醛固定。制備腦組織石蠟快，采取連續(xù)切片法，以移植部位為中心連續(xù)冠狀切片。采用BCIP/NBT及AEC兩種不同的顯色系統(tǒng)，分別進(jìn)行BrdU抗體+Nestin抗體、BrdU抗體+MAP2抗體、BrdU抗體+GFAP抗體雙染免疫組化分析，觀察神經(jīng)干細(xì)胞移植到大鼠紋狀體后在宿主腦內(nèi)的存活及分化情況。 結(jié)

14、論： 1、本實(shí)驗(yàn)成功分離和培養(yǎng)了來源于胚胎大鼠紋狀體的NSCs，并證明它們具備了NSCs的基本特征：(1)表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志性蛋白Nestin；(2)在培養(yǎng)中存活的NSCs可由單個(gè)細(xì)胞形成神經(jīng)細(xì)胞球，表明具有自我更新、自我增殖能力；(3)在誘導(dǎo)分化條件下具有形成神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的能力。NSCs的自我增殖特性和多向分化潛能不因細(xì)胞傳代而改變。 2、向大鼠紋狀體內(nèi)微量灌注含有高滴度抗神經(jīng)抗體的TS患者血清，可以成功誘導(dǎo)出