雌激素受體在去勢大鼠牙周膜干細(xì)胞成骨分化中作用的研究.pdf

1、絕經(jīng)后婦女易出現(xiàn)骨質(zhì)疏松，已證實這一現(xiàn)象和體內(nèi)的雌激素缺乏有關(guān)，雌激素水平降低可加速體內(nèi)的骨轉(zhuǎn)換過程，導(dǎo)致骨吸收大于骨形成，從而使體內(nèi)的骨量減低，引發(fā)骨質(zhì)疏松。如今，骨質(zhì)疏松已被認(rèn)為是誘發(fā)牙周疾病及牙齒喪失的危險因素之一。通過對絕經(jīng)后婦女的臨床研究表明，在口腔衛(wèi)生保持不變的情況下，雌激素缺乏的患者牙周病發(fā)病率升高。動物實驗也已經(jīng)證實，去除卵巢的雌性大鼠其下頜骨密度降低。然而，雌激素缺乏對牙周組織影響的分子機(jī)制仍不明確。
　　牙周膜

2、（periodontalligament，PDL）是一種特殊的、富含血管的連接牙骨質(zhì)和牙槽骨的組織，它的存在使得牙齒被固定在牙槽窩里。以往研究表明，在人的牙周膜中含有一些異質(zhì)性的細(xì)胞群體，這些細(xì)胞能夠在體外分化為成牙本質(zhì)細(xì)胞及成骨細(xì)胞。2004年，施松濤教授等人證實，牙周膜韌帶中含有牙周膜干細(xì)胞（periodontalligamentstemcells，PDLSCs），此類細(xì)胞對牙周組織的再生有著至關(guān)重要的作用。
　　雌激素積極地

3、參與骨代謝過程并且有著多功能的調(diào)控作用，這在很多研究中已得到證實。它對靶細(xì)胞的調(diào)控作用主要通過雌激素受體（estrogenreceptor，ER）發(fā)揮作用。雌激素受體存在于很多細(xì)胞中，比如骨髓基質(zhì)干細(xì)胞（bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs），牙周膜成纖維細(xì)胞（periodontalligamentfibroblast，PLF）中，并且，在這些細(xì)胞的成骨分化過程中，雌激素受體起到了重要的調(diào)控作用。但具

4、體的調(diào)控機(jī)制不明。
　　因此，我們利用去勢大鼠營造了一個低雌激素的微環(huán)境，提取其牙周膜干細(xì)胞，觀察其成骨分化的過程，進(jìn)而研究雌激素受體在此過程中的調(diào)控作用以及分子機(jī)制。實驗設(shè)計如下：
　　實驗內(nèi)容：
　?。?）去勢大鼠骨質(zhì)疏松動物模型建立
　　實驗分為兩組：去勢組和假手術(shù)組。實驗組采用外科手術(shù)的方法，切除雌性SD大鼠的雙側(cè)卵巢（ovariectomy，OVX），建立骨質(zhì)疏松的動物模型，假手術(shù)組切除卵巢周圍少量脂肪

5、組織。3個月后，觀察兩組大鼠體重、血清雌激素水平以及股骨骨密度（BMD）。
　?。?）去勢大鼠牙周膜干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定
　　動物模型構(gòu)建成功后，拔出兩組大鼠的4個第一磨牙，刮下根中部表面上的牙周韌帶組織，采用酶消化+組織塊法培養(yǎng)原代細(xì)胞，利用免疫磁珠技術(shù)對此種細(xì)胞進(jìn)行篩選、純化，從而獲得STRO-1高表達(dá)的牙周膜干細(xì)胞。利用倒置顯微鏡觀察、增殖速率的測定比較兩組大鼠生物學(xué)特性的區(qū)別。而后，通過流式細(xì)胞儀檢測及成骨誘導(dǎo)鑒

6、定獲得的牙周膜干細(xì)胞。
　?。?）雌激素受體對去勢大鼠牙周膜干細(xì)胞成骨分化能力的影響
　　利用實時定量PCR的方法，觀察大鼠牙周膜干細(xì)胞成骨分化過程中雌激素受體及成骨指標(biāo)的變化。而后，在雌激素刺激及慢病毒干涉載體下調(diào)雌激素受體后，檢測成骨指標(biāo)的變化。
　?。?）雌激素受體對去勢大鼠牙周膜干細(xì)胞Notch信號通路的影響
　　文獻(xiàn)表明，Notch信號通路與細(xì)胞的成骨分化關(guān)系密切，因此，本實驗擬以Notch信號通路為切

7、入點，初步探討雌激素受體影響牙周膜干細(xì)胞成骨能力的分子機(jī)制。首先，觀察了牙周膜干細(xì)胞成骨分化過程中Notch受體（Notch1）及配體（Jagged1）基因和蛋白的表達(dá)，而后，檢測了雌激素刺激后及下調(diào)雌激素受體表達(dá)后Notch信號通路的變化。
　　結(jié)果：
　?。?）術(shù)后3個月，兩組間大鼠體重、雌激素水平及股骨骨密度均具有統(tǒng)計學(xué)差異。去勢組大鼠體重增加，雌激素水平和股骨骨密度降低。
　?。?）通過流式細(xì)胞儀分析，與未篩選

8、前的牙周膜細(xì)胞相比，牙周膜干細(xì)胞呈現(xiàn)STRO-1及CD146的高表達(dá)，這表明我們獲得了純化較好的牙周膜干細(xì)胞。MTT結(jié)果顯示，去勢后，大鼠牙周膜干細(xì)胞增殖速率變快。
　?。?）牙周膜干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)過程中，去勢組牙周膜干細(xì)胞的堿性磷酸酶活性、雌激素受體及成骨基因的表達(dá)低于假手術(shù)組，茜素紅染色結(jié)果證實了以上結(jié)論。最后，在17β-雌二醇的刺激下，牙周膜干細(xì)胞的成骨分化能力增強(qiáng)；下調(diào)ERα和ERβ表達(dá)后，牙周膜干細(xì)胞的成骨分化能力減弱。<

9、br>　?。?）Real-timePCR及Westernblot的結(jié)果表明，去勢大鼠牙周膜干細(xì)胞的成骨分化過程中，Notch信號通路中受體Notch1、配體Jagged1在基因及蛋白的水平上均有表達(dá)。給予雌激素刺激后，Notch受體和配體的表達(dá)都有不同程度升高；下調(diào)ERα和ERβ表達(dá)后，Notch受體和配體表達(dá)升高的程度降低。
　　結(jié)論：
　?。?）去勢大鼠牙周膜干細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)但成骨能力減弱，雌激素受體在雌激素介導(dǎo)的牙