Gli1在人牙周膜干細胞應力成骨過程中的調(diào)控作用.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、正畸治療過程中牙位移動的原理是:持久的矯治力作用在牙齒上,牙齒周圍的骨組織發(fā)生改建,從而引導牙齒的移動,是建立在牙周組織受力后發(fā)生的生物學改建基礎上,包括牙齒及其周圍的附著結構如牙骨質(zhì)、牙周膜及牙槽骨的移動改建。但牙的移動并不是簡單的機械移位,在整個過程中,成骨細胞和破骨細胞的共同參與,相互協(xié)調(diào)使牙槽骨發(fā)生選擇性吸收和形成即在壓力側發(fā)生骨的吸收,張力側有新骨的形成。而牙槽骨的改建由牙周膜介導,因此牙齒移動首先表現(xiàn)為牙周膜現(xiàn)象。在牙周膜中

2、存在一種有多向分化,自我更新,克隆形成能力的干細胞,即人牙周膜干細胞(PDLSCs),它為牙周組織包括牙槽骨的再生提供新的細胞來源。研究表明,牙周膜干細胞在應力作用下可分化為成骨細胞和軟骨細胞,在牙槽骨改建的起著關鍵作用。干細胞向成骨細胞轉化并不是一個單一的過程,而是由眾多生長因子和通路共同作用的結果。但其具體機制目前還不十分清楚。
  Hedgehog信號參與了胚胎發(fā)育期間各種組織器官的形成,特別是在骨的生長發(fā)育過程中起了重要的

3、調(diào)節(jié)作用。研究表明,Hedgehog信號途徑介導了間充質(zhì)干細胞(MSCs)向成骨,軟骨細胞轉化和軟骨骨化的一系列過程。多種因素可直接或間接通過調(diào)控Hh信號通路從而使間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化。本課題組前期證實了周期性張應力可促進PDLSCs向成骨細胞分化,并證實了Hh信號通路參與了PDLSCs應力成骨過程。
  Gli1(Gliloma-associated oncogene homoglog)是Hh信號通路中重要的轉錄因子,是該

4、通路激活的最重要標志,其如何通過調(diào)控Hh信號通路來影響PDLSCs成骨的分子機制還少有研究。因此,本實驗擬構建過表達Gli1基因腺病毒載體,并轉染PDLSCs細胞,探討上調(diào)Gli1基因對PDLSCs增殖及其在應力作用下成骨分化的影響,為進一步了解在應力作用下牙齒生理性移位時牙槽骨的改建機制而打下一定的實驗基礎。
  目的通過體外構建Gli1基因腺病毒載體,以此上調(diào)入牙周膜干細胞(PDLSCs)中Gli1基因的表達,從而探討其對人P

5、DLSCs增殖及應力成骨分化的影響
  方法:
  1.人牙周膜干細胞分離、培養(yǎng)和鑒定
  牙齒標本是來自于在臨床上因矯正需要而拔除的牙周健康的新鮮前磨牙(年齡在12~24歲之間),并經(jīng)患者及其家屬知情同意。用含1%雙抗的PBS反復沖洗牙齒后,在牙根中1/3部位單向刮取牙周膜組織,用酶消化聯(lián)合組織塊法進行原代培養(yǎng)。將用Ⅰ型膠原酶消化45分鐘后的組織混懸液離心后接種于六孔板內(nèi),二天后第一次換液,之后每3天換液,收集獲得牙

6、周膜細胞,用流式細胞分選術得到PDLSCs。在鏡下通過觀察細胞形態(tài)和它的克隆形成能力、采用流式細胞術分析其細胞表面標志物CD146、免疫組化法檢測波形蛋白和角蛋白的表達以及對其進行成骨成脂誘導分化實驗來鑒定其干細胞特性。
  3.腺病毒轉染
  用攜帶Gli1特異性過表達的腺病毒感染PDLSCs,Western blot檢測PDLSCs中Gli1的表達情況。實驗分為三組:即正常細胞對照組PDLSCs/正常組、空腺病毒感染的P

7、DLSCs/空載組和由攜帶Gli1特異性過表達腺病毒感染的PDLSCs/Gli1過表達組。
  4.細胞應力加載
  分別取上述第4~6代三組細胞,接種于BioFlex專用的板底為硅膠模的六孔板內(nèi)培養(yǎng)。使用FX-4000T加載系統(tǒng)(達到國際標準化水平)以最大形變量12%,最小形變量為0的正弦波對三組細胞進行動態(tài)張應力的加載,頻率為0.1Hz(即5s拉伸5s放松),設定作用時間為0h(在同等條件下靜置培養(yǎng))、6h、12h、24

8、h。收集細胞,提取蛋白,Westernblot檢測Hh信號通路的相關效應蛋白Gli1、PTCH1和PDLSCs成骨相關標志物Runx2、ALP的表達改變。
  結果:
  1、原代培養(yǎng)出的牙周膜細胞,鏡下呈三角形或長梭形,梭形兩端有的有突起和分叉,可與鄰近細胞突起連接;通過流式細胞術分選所得PDLSCs陽性率為94.8%(細胞抗體為CD146)。分選所得的PDLSCs具有克隆形成能力;經(jīng)免疫組化檢測顯示角蛋白表達陰性,波形蛋

9、白陽性,表明其來源為間充質(zhì)。PDLSCs成脂誘導3周后,胞漿內(nèi)可見脂滴,油紅O染色陽性,成骨誘導3周后,鏡下可見散在礦化結節(jié),茜素紅染色陽性,說明所得的PDLSCs具有成骨、成脂等多向分化能力。
  2、western blot檢測轉染過表達Gli1腺病毒后的PDLSCs中基因的Gli1的轉錄水平變化,結果顯示在轉染48h后,Gli1蛋白的表達量增加[灰度值(0.041±0.024)和(0.148±0.017),P<0.05],說

10、明腺病毒載體能夠有效的上調(diào)目的蛋白Gli1的表達。
  3、對三組PDLSCs進行同一加載方式和不同加載時間的應力加載后,提取蛋白,western blot檢測相關蛋白的表達,結果如下:
  (1)PDLSCs/正常組加力后成骨相關標志物Runx2和ALP的表達較未加力時升高,說明在應力刺激下PDLSCs成骨分化的能力增強。
  (2)PDLSCs/正常組加力后檢測Hh通路中的Ptch蛋白、下游的Gli1因子及ALP和

11、Runx2的表達水平都比未加力時升高,并隨著時間延長有所增加,說明Hh信號通路參與了PDLSCs應力成骨過程。
  (3)PDLSCs/正常組、PDLSCs/空載組和PDLSCs/Gli1過表達組加力后,Ptch、Gli1、Runx2和ALP的表達水平隨著時間延長先升高后有所降低,只是增加的程度不同,在加力時間相同情況下,PDLSCs/Gli1過表達組Runx2和ALP的表達水平比PDLSCs/正常組明顯,這表明Gli1具有促進P

12、DLSCs應力成骨分化作用。
  結論:
  1.運用本課題組前期分離培養(yǎng)方法培養(yǎng)出來的人牙周膜干細胞被證實有克隆形成能力,高表達干細胞表面標志物,在特定誘導環(huán)境下具有多向分化潛能。證明此方法(酶消化聯(lián)合組織塊法)是有效可行的。
  2.過表達Gli1腺病毒感染PDLSCs后,減慢了PDLSCs增殖速率,而Gli1基因可以呈現(xiàn)穩(wěn)定的高表達。
  3.細胞應力加載后的相關檢測結果說明:PDLSCs的成骨能力隨著加力

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