組織工程人工角膜內(nèi)皮載體膜片的制備、性質(zhì)及對(duì)角膜內(nèi)皮損傷修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、甲殼素廣泛存在于低等動(dòng)物，特別是節(jié)肢動(dòng)物的外殼、真菌及一些藻類(lèi)細(xì)胞的細(xì)胞壁中，是一種天然的生物高分子多糖。甲殼素經(jīng)過(guò)脫乙?；磻?yīng)成為殼聚糖，它是一種天然聚陽(yáng)離子功能性生物多糖，具有優(yōu)良的生物相容性，在體內(nèi)可降解成為機(jī)體所需的氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖，在生物醫(yī)用材料和組織工程方面得到較廣泛研究和應(yīng)用。 角膜內(nèi)皮細(xì)胞是位于角膜后部的單層細(xì)胞，前面與后彈力層相連，后面與房水相接觸。角膜內(nèi)皮細(xì)胞在維持正常角膜脫水狀態(tài)、角膜厚度、透

2、明度方面起著關(guān)鍵作用。目前，穿透性角膜移植術(shù)是取代病變或受損的內(nèi)皮細(xì)胞恢復(fù)角膜透明性的唯一方法。但是供體來(lái)源的短缺、老年化及術(shù)后免疫排斥反應(yīng)的發(fā)生，直接影響著角膜移植手術(shù)的開(kāi)展和成敗。組織工程學(xué)是一門(mén)以細(xì)胞生物學(xué)和材料學(xué)相結(jié)合，進(jìn)行體外或體內(nèi)構(gòu)建組織或器官的新興科學(xué)，利用組織工程方法體外構(gòu)建人工角膜內(nèi)皮是解決角膜內(nèi)皮盲的有潛力的途徑，而供內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的體外載體的研究成為組織工程角膜內(nèi)皮研究的關(guān)鍵。目前供內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)的體外載體報(bào)道最多的是

3、同種異體或異種角膜的后彈力層(DM)，由于后彈力層上有層粘連蛋白(LN)存在，而層粘連蛋白(LN)在內(nèi)皮細(xì)胞貼壁的過(guò)程中起著重要作用，因此后彈力層是內(nèi)皮細(xì)胞的最佳底物。除了DM外，報(bào)道的載體尚有可生物降解的聚合物PLLA和PLGA、水凝膠膜、膠原膜、明膠薄膜以及羊膜等。但上述載體各有缺點(diǎn)，距離臨床有較大距離，而且沒(méi)有以多糖為主要材料的角膜內(nèi)皮載體見(jiàn)到報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選擇甲殼素及其衍生物為基本材料，通過(guò)與其他多糖的共混，制備出適合角膜內(nèi)皮細(xì)胞

4、生長(zhǎng)的膜片，以期解決角膜內(nèi)皮缺損的問(wèn)題。 本實(shí)驗(yàn)取得以下幾個(gè)方面成果和進(jìn)展： 1、系統(tǒng)的研究了甲殼素、殼聚糖原料和不同脫乙酰度殼聚糖和產(chǎn)物的性質(zhì)。研究了甲殼素、殼聚糖及其羧甲基衍生物的純化方法，制備出符合體內(nèi)應(yīng)用的高純度，無(wú)菌無(wú)熱原醫(yī)用材料。對(duì)殼聚糖的脫乙酰度與生物相容性和生物降解性之間的關(guān)系進(jìn)行了初步研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)脫乙酰度越高降解速度越慢，而高脫酰度的殼聚糖生物相容性與低脫乙酰度的類(lèi)似，但炎癥反應(yīng)發(fā)生的時(shí)機(jī)要晚一些，這

5、與其炎癥反應(yīng)的機(jī)制有關(guān)。對(duì)羧甲基殼聚糖和羧甲基甲殼素的生物相容性進(jìn)行了初步評(píng)價(jià)，MTT法測(cè)試不同濃度的材料對(duì)L929小鼠成纖維細(xì)胞相對(duì)增值率的影響，結(jié)果證明兩種原料的毒性分級(jí)為0級(jí)，屬于無(wú)毒性材料。 2、制備出殼聚糖硫酸一軟骨素(Ch-Cs)、殼聚糖一羧甲基殼聚糖(Ch-Cm)、殼聚糖一透明質(zhì)酸(Ch-Ha)三種共混膜，研究了三種共混膜的透光性、親水性、通透性、機(jī)械性能、表面結(jié)構(gòu)、蛋白吸附能力、紅外圖譜以及生物相容性和生物降解性

6、。結(jié)果表明三種共混膜都具有良好的透明性、親水性和機(jī)械性能以及粗糙的表面結(jié)構(gòu)，并且對(duì)蛋白有較好的吸附能力，但三種共混膜之間略有差異。綜合對(duì)比三種共混膜，篩選出Ch-Cs物理化學(xué)性質(zhì)最為合適。研究了兔角膜上皮細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)技術(shù)，研究了貓角膜內(nèi)皮細(xì)胞的原代和傳代培養(yǎng)技術(shù)，能體外獲得大量高純度的角膜細(xì)胞。以不同類(lèi)型的殼聚糖共混膜為支架進(jìn)行體外培養(yǎng)角膜基質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究。觀察兔角膜基質(zhì)細(xì)胞、上皮細(xì)胞和內(nèi)

7、皮細(xì)胞在不同共混膜上的生長(zhǎng)情況，研究不同類(lèi)型共混膜與角膜細(xì)胞的生物相容性，結(jié)果說(shuō)明三種共混膜片與角膜上皮和基質(zhì)細(xì)胞都具有較好的生物相容性，而Ch-Cs共混膜最適合角膜內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，被確定為本研究的角膜內(nèi)皮載體材料。 3、從體外酶解-體內(nèi)肌肉植入-眼角膜基質(zhì)層間植入三個(gè)層面評(píng)價(jià)了Ch-Cs共混膜的生物降解性和生物相容性，各實(shí)驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)出相同的特點(diǎn)：共混膜片能夠逐步降解，肌肉植入和層間植入顯示其具有良好的生物相容性和降解性。其中，溶

8、菌酶降解實(shí)驗(yàn)證明共混膜能夠在21天內(nèi)被降解成碎片，而大鼠肌肉植入實(shí)驗(yàn)說(shuō)明共混膜能夠在60天內(nèi)基本被降解吸收，組織反應(yīng)比較溫和。植入到貓角膜內(nèi)的膜片在觀察期內(nèi)完全沒(méi)有炎癥反應(yīng)，沒(méi)有免疫排斥，動(dòng)物角膜長(zhǎng)時(shí)間保持透明，在植入第35天時(shí)膜片基本被吸收，該結(jié)果在同類(lèi)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)最好。 4、首次對(duì)水溶性致孔劑進(jìn)行了大量的篩選，包括麥芽糖、脲、檸檬酸、硫酸鎂、硫酸銨、硫酸鉀、醋酸鈉、氯化鎂、醋酸鉀等多種化合物。通過(guò)光鏡、電鏡觀察和通透性實(shí)驗(yàn)證明

9、醋酸鉀在對(duì)膜片表面結(jié)構(gòu)和通透性改進(jìn)方面具有較好的效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)不同醋酸鉀致孔的Ch-Cs共混膜片的通透性都優(yōu)于截留分子量為8000道爾頓的醋酸纖維素透析袋膜片，其中醋酸鉀致孔劑質(zhì)量為膜片固形物兩倍時(shí)的膜片通透性最好，并且有著合適的表面結(jié)構(gòu)。利用研制的兩種特定曲率多糖膜片制膜設(shè)備，制備出特定曲率的、透明性和機(jī)械性能良好并且適合角膜內(nèi)皮細(xì)胞貼附與生長(zhǎng)的曲率膜片。 5、以曲率膜片為載體，分別進(jìn)行了兔、貓組織工程角膜內(nèi)皮支架的構(gòu)