組織工程人角膜內皮的體外重建及其動物移植試驗.pdf

1、人角膜內皮層(HCE)由單層的六角形人角膜內皮細胞(HCE細胞)鑲嵌而成,是前房房水和角膜基質之間的滲漏性屏障,HCE細胞質膜上所擁有的諸多膜運輸?shù)鞍淄ㄟ^發(fā)揮“泵”功能使整個角膜處于半脫水狀態(tài),在維持角膜正常厚度和其透明性進而保障眼睛發(fā)揮正常視功能方面具有不可替代的作用。遺憾的是,成人的HCE細胞喪失了增殖能力,而且數(shù)量還在逐年減少,HCE單層完整性的維持只能靠鄰近HCE細胞的擴大和移行來實現(xiàn)。一旦受到病原體感染、機械損傷和非生理性脅迫

2、等,HCE細胞死亡的速率更快,輕者會造成不可逆角膜病變——角膜內皮功能失代償(corneal endothelial dysfunction),重者將會致盲——角膜內皮盲(primary corneal endotheliopathy),角膜內皮病盲在因角膜病變所導致的視力障礙中位于第二位。角膜移植是目前治療角膜內皮病盲的唯一辦法,因HCE異常僅僅是由于HCE細胞數(shù)量不足造成的,故絕大多數(shù)角膜內皮病盲患者均可通過角膜移植而治愈,但由于捐

3、獻角膜數(shù)量的高度匱乏,致使可用于角膜移植的供體角膜材料嚴重不足,眾多角膜內皮病盲患者無法通過角膜移植重見光明。
　　目前,組織工程人角膜內皮(tissue-engineered human corneal endothelium, TE-HCE)被公認為是治療角膜內皮病盲的天然HCE的等效替代物,已成為廣大角膜內皮病盲患者恢復視力和復明的唯一希望。但迄今為止,仍沒有可用于臨床HCE移植的TE-HCE產品問世。本文在前期研究工作的基

4、礎上,利用表型、核型和功能蛋白表達正常且沒有致瘤性的人角膜內皮單克隆細胞株細胞(monoclonal human corneal endothelial cells, mcHCE細胞)為種子細胞,以理化性能正常、安全性高且生物相容性理想的薄化去上皮層修飾羊膜( modified denuded-epithelium amniotic membrane, mdAM)為載體支架,在體外重建出了形態(tài)和組織結構正常的TE-HCE,并利用家貓和獼

5、猴進行了動物角膜的穿透性后板層角膜移植試驗,旨在獲得可使移植動物角膜長期維持透明的TE-HCE,為可用于臨床HCE移植的TE-HCE新產品的生產和臨床應用奠定基礎。
　　用于 TE-HCE體外重建的種子細胞為來自非轉染無致瘤性 HCE細胞系(utHCEC01)的第38代mcHCE細胞。在用作種子細胞開展TE-HCE體外重建之前,分別對其細胞屬性、功能蛋白的表達以及致瘤性進行了檢測和鑒定。檢測結果顯示,第38代mcHCE細胞呈近似六

6、角形的多邊形內皮樣細胞形態(tài),透明度高,形態(tài)大小均一,細胞群體倍增時間為41.07 h,染色體數(shù)目為2n=46條,表明該細胞株細胞的生長狀態(tài)良好,分裂增殖能力旺盛;第38代 mcHCE細胞仍維持有標志蛋白——人血管內皮生長因子受體-2(Flk1)和人 IV型膠原蛋白的陽性表達,表明該細胞株細胞保持有HCE細胞的固有屬性;細胞連接蛋白的免疫熒光檢測結果顯示,第38代mcHCE細胞仍保持有緊密連接蛋白1(ZO-1)、N-鈣粘蛋白(N-Cadh

7、erin)、間隙連接蛋白-43(CX-43)和整聯(lián)蛋白αv/β5(Integrinαv/β5)的陽性表達,表明該細胞株細胞具有在細胞間以及細胞與細胞外基質間形成細胞連接的潛能;第38代 mcHCE細胞還維持有細胞膜運輸?shù)鞍住薔a+/K+ATPase、人氯離子通道蛋白-2( hCLCN2)、Na+/HCO3-協(xié)同轉運蛋白(hSLC4)和人水孔通道蛋白-1(AQP1)的陽性表達,表明該細胞株細胞具有發(fā)揮正常膜運輸功能的潛能;第38代mc

8、HCE細胞在裸鼠皮下接種后沒有腫瘤出現(xiàn),證實該細胞株細胞沒有致瘤性。綜合上述檢測和鑒定結果,證明第38代mcHCE細胞形態(tài)結構、屬性和功能正常,且沒有致瘤性,可以被用作 TE-HCE體外重建的種子細胞。
　　本文利用胰酶-EDTA倒置消化法對去上皮層羊膜進行薄化處理,再使用專用信號分子包被,制得薄化 mdAM。在用作載體支架進行 TE-HCE體外重建之前,分別對其進行理化性質、生物學性質以及其與第38代 mcHCE細胞的生物相容性

9、進行檢測和評價。結果顯示,薄化 mdAM只有基底膜和致密層組成,且上皮面光滑平整;厚度均一,平均厚度約為28.47μm;透明度和透光率良好,可見光區(qū)的透光率在90％以上;重金屬含量符合國家對可吸收植入型醫(yī)用生物材料的要求。薄化 mdAM無熱源和眼刺激性;皮下植入后無炎癥反應且降解速度比瑞濟生物羊膜快;且與第38代mcHCE細胞具有良好的生物相容性。綜上所述,薄化 mdAM具有良好的理化和生物學性能,安全性高,且與 mcHCE細胞生物相容

10、性良好,可以被用作TE-HCE體外重建的載體支架。
　　本文以上述mcHCE細胞為種子細胞、以薄化mdAM為載體支架,用含20%FBS的 DMEM/F12(1:1)完全培養(yǎng)液,在37℃、5%CO2的培養(yǎng)條件下進行了TE-HCE的體外重建。每24 h茜素紅染色結果顯示,重建96 h后種子細胞便可在載體支架上形成完整連續(xù)的細胞層,細胞與細胞間著色清晰,細胞呈近似六角形內皮樣形態(tài),細胞密度為3487±99.04個/mm2;組織結構和超微

11、結構鑒定結果顯示,體外重建96 h所得的TE-HCE具有完整連續(xù)的角膜內皮細胞單層,多角形細胞中具有一定數(shù)量的線粒體和內質網(wǎng),細胞與細胞間、細胞與載體支架間具有多處細胞連接樣結構,與正常HCE的組織結構和超微結構相似。免疫熒光檢測結果顯示,體外重建96 h所得的TE-HCE仍維持有細胞緊密連接蛋白1(ZO-1)、N-鈣粘蛋白(N-Cadherin)、間隙連接蛋白-43(CX-43)和整聯(lián)蛋白αv/β5(Integrinαv/β5)的陽性

12、表達,表明體外重建96 h所得的TE-HCE具有形成緊密連接復合體進而形成前房房水與角膜基質間滲漏性屏障的潛能。綜上所述,體外重建96 h所得TE-HCE具有與正常HCE相似的形態(tài)特征、組織結構和超微結構,可以作為正常HCE的等效替代物,被認為可以用于角膜內皮病盲的臨床治療。
　　為了進一步評價所重建的TE-HCE在體內是否具有正常HCE的生理功能。本文選用自身角膜內皮細胞沒有增殖能力的家貓和獼猴作為實驗動物。首先撕除實驗眼的后彈

13、力層和內皮層,然后進行帶DiI熒光標記的TE-HCE和mdAM(對照組)的后板層角膜移植。移植后用裂隙燈顯微鏡、角膜測厚儀和眼壓計跟蹤觀察其透明度、厚度和眼壓的變化情況,并在家貓移植104天,獼猴移植181天時取材進行DiI熒光標記、茜素紅染色及細胞密度、組織結構和超微結構的離體鑒定,此外家貓還進行了房水蛋白變化的鑒定。結果顯示,家貓和獼猴 TE-HCE移植眼的角膜均未出現(xiàn)水腫和排斥等不良反應,角膜厚度逐漸下降,并逐漸恢復透明;而mdA

14、M實驗眼,角膜水腫嚴重且不透明;但TE-HCE移植眼、mdAM移植眼和正常對照眼的眼壓在觀察期間均在上下波動,沒有明顯的相關性。離體檢測結果顯示,家貓和獼猴 TE-HCE移植眼角膜中央移植區(qū)的內皮細胞均帶有DiI熒光標記,且形態(tài)大小均一,多為六角形鑲嵌內皮樣形態(tài),細胞密度分別為2573.33±0.59個/mm2和2780.00±0.77個/mm2,與他們各自正常對照眼的形態(tài)和細胞密度相近,而 mdAM移植眼角膜中央移植區(qū)均沒有內皮細胞,

15、這表明,家貓和獼猴TE-HCE移植眼角膜中央移植區(qū)的內皮細胞均來自所植入的TE-HCE,且具有與正常對照眼相似的形態(tài)特征和細胞密度。家貓和獼猴TE-HCE移植眼角膜的組織結構和超微結構與正常對照眼角膜相似,但獼猴TE-HCE移植眼角膜在移植181天后HCE細胞仍沒有分泌形成新的后彈力層。家貓TE-HCE移植眼和正常對照眼房水蛋白的二維電泳的分析結果顯示,TE-HCE移植眼與正常對照眼房水蛋白分離斑點的重復性較好,匹配的 Corr系數(shù)達到

16、0.8以上。綜上所述, TE-HCE在家貓和獼猴體內具有正常 HCE的生理功能,能夠維持家貓和獼猴移植角膜的正常厚度和長期透明性。
　　綜上所述,利用表型、核型和功能蛋白表達正常且沒有致瘤性的mcHCE細胞為種子細胞,以理化性能正常、安全性高且生物相容性理想的薄化 mdAM為載體支架,在體外重建96 h后即可獲得形態(tài)特征和組織結構近似正常 HCE的TE-HCE,且移植到自身角膜內皮細胞無增殖能力且撕除后彈力層和內皮層的家貓和獼猴角