角膜組織工程

1、疑問,（1）到底什么是角膜？,（2）常說(shuō)的角膜移植是怎么回事？,（3）角膜移植中的角膜來(lái)源于哪里？,（4）盲人，近視，遠(yuǎn)視，白內(nèi)障都可以進(jìn)行角膜移植而恢復(fù)視力嗎？,角膜,,眼角膜是眼睛前端一層透明薄膜 ，角膜完全透明，位于眼球前部，呈橫橢圓形。角膜有十分敏感的神經(jīng)末梢，如有外物接觸角膜，眼瞼便會(huì)不由自主地合上以保護(hù)眼睛。,角膜分為五層，組織學(xué)上從前向后分為：①上皮細(xì)胞層：厚約35μm，由5～6層鱗狀上皮細(xì)胞組成，無(wú)角化，排列特別整齊，

2、易與其內(nèi)面的前彈力層分離；②前彈力層：厚約12μm，為一層均質(zhì)無(wú)細(xì)胞成分的透明膜；,,③基質(zhì)層：厚約500μm，占角膜厚度的90%，由近200層排列規(guī)則的膠原纖維束薄板組成，其間有角膜細(xì)胞和少數(shù)游走細(xì)胞，并有粘蛋白和糖蛋白填充；④后彈力層：為較堅(jiān)韌的透明均質(zhì)膜，成年人厚約10～12μm；⑤內(nèi)皮細(xì)胞層：厚5μm，為一層六角形扁平細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞頂部朝向前房，基底面向后彈力層。,,角膜移植,概念 用正常的眼角膜替換患者現(xiàn)有病

3、變的角膜，使患眼復(fù)明或控制角膜病變，達(dá)到增進(jìn)視力或治療某些角膜疾患的眼科治療方法。,,,適用癥狀,適合于各種原因造成的角膜混濁或水腫而嚴(yán)重影響視力的病變 。例如：病毒性角膜炎 被酸、堿化學(xué)物燒傷的角膜混濁患者 先天性角膜變性、圓錐角膜、角膜基質(zhì)變性、角膜內(nèi)皮細(xì)胞功能失代償?shù)然颊?角膜腫瘤、角膜瘺、角膜葡萄腫患者 已失明的角膜白斑患者,材料來(lái)源,傳統(tǒng) 現(xiàn)代,,,活體捐贈(zèng),尸體捐贈(zèng),,,活體捐贈(zèng),尸體捐贈(zèng),人工角膜,

4、活體捐贈(zèng)顧名思義供體是活人，因外傷、視神經(jīng)疾患、顱內(nèi)疾患等原因?qū)е率鳎o(wú)光感）而角膜卻是完好無(wú)損的眼球，均是合適的供體。,,返回,人工角膜,基本簡(jiǎn)介　　世界上超過1000萬(wàn)人的眼盲是由角膜病引起，為導(dǎo)致眼盲的第二大原因，僅次于白內(nèi)障。其中80%可以通過角膜移植手術(shù)脫盲。然而，傳統(tǒng)的角膜移植手術(shù)有其兩大弊端，一是角膜供體的來(lái)源困難，二是手術(shù)成功率低。人工角膜的出現(xiàn)及應(yīng)用為角膜盲患者帶來(lái)了希望。,基本結(jié)構(gòu),人工角膜是用醫(yī)用高分子

5、材料制成的類似人體角膜的產(chǎn)品 。人工角膜材料,,無(wú)機(jī)材料,有機(jī)材料,生物材料,玻璃，羥基磷灰石 ， 生物玻璃陶瓷,硅凝膠 ，聚甲基丙烯酸甲酯 ，氟碳多聚體,羊膜，動(dòng)物膠原和殼聚糖，黏多糖,組織工程角膜,,光學(xué)鏡柱,周邊支架,聚甲基丙烯酸羥乙酯(PHEMA）、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA）、硅凝膠、玻璃,陶瓷、氟碳聚合物、羥基磷灰石、生物材料、聚四氟乙烯,,角膜設(shè)計(jì)中，較為成功的是AlphaCor、Do

6、hlman-Doan和Osteo-Odonto， 并獲得了FDA 批準(zhǔn)，進(jìn)入臨床階段。,種子細(xì)胞特點(diǎn),（1）具有較高的增殖能力 （2）能夠長(zhǎng)期維持其生理功能和生物活性,種子細(xì)胞（角膜緣干細(xì)胞）,1.取材 取一塊大小為1×2mm2，深度為基質(zhì)前的角膜緣組織一塊。,,Tsai R, et al. N Engl J Med. 2000;343:86-93,,2.培養(yǎng) 采用組織塊培養(yǎng)法和酶消化法。所用的培養(yǎng)基采用DMEM與F－

7、12培養(yǎng)基1：1混合，加入10％胎牛血清，5ng/ml的胰島素，10 ng/ml的上皮生長(zhǎng)因子。消化酶使用0.25％胰蛋白酶－0.02％EDTA的混合物。,,,Tsai R, et al. N Engl J Med. 2000;343:86-93,,觀察培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)情況 2－3天換液一次，在倒置顯微鏡下觀察角膜緣上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)情況。 培養(yǎng)細(xì)胞標(biāo)記物染色 將培養(yǎng)的角膜緣上皮細(xì)胞固定，進(jìn)行間接免疫組織化學(xué)染色。選用AE5抗角蛋白抗

8、體，特異性識(shí)別角蛋白K3；4A4核轉(zhuǎn)錄因子p63的特異性抗體,特異性識(shí)別p63。,,3.移植,Tsai R, et al. N Engl J Med. 2000;343:86-93,角膜緣干細(xì)胞理論的建立,1971年，Davanger等研究發(fā)現(xiàn)角膜緣是角膜上皮增殖和移行的動(dòng)力根源，據(jù)此提出角膜緣干細(xì)胞存在的假說(shuō) 。1986年，Schermer等首次通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)角膜緣基底細(xì)胞缺乏特異性分化蛋白K3，為角膜緣干細(xì)胞的解剖部位提供了間接依據(jù)

9、。,角膜緣干細(xì)胞的解剖定位,角膜緣為角膜和結(jié)膜、鞏膜交界的部分 在基底部乳頭形成特殊的“柵欄”(limbal palisades of vogt)樣結(jié)構(gòu),,,結(jié)膜 角膜緣 周邊角膜 中央角膜,角膜緣干細(xì)胞理論建立的意義,認(rèn)知了多種眼表疾病的發(fā)病機(jī)理找到了許多眼表重建手術(shù)及角膜移植術(shù)失敗的原因,角膜緣干細(xì)胞移植的意義,角膜緣干

10、細(xì)胞移植是角膜緣干細(xì)胞缺乏患者恢復(fù)眼表完整性和重建邊緣屏障作用的有效方法。,角膜緣干細(xì)胞移植的局限性,異體供眼來(lái)源有限，而且存在免疫排斥反應(yīng)，可能導(dǎo)致移植失敗。對(duì)單眼角膜緣干細(xì)胞受損患者的健眼取材（大于2/3圓周）有造成健眼角膜緣干細(xì)胞缺乏的潛在威脅 。因此目前認(rèn)為對(duì)角膜緣干細(xì)胞先行體外培養(yǎng)擴(kuò)增后再行移植術(shù)是非常有前景的治療方法。,Chen J, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci,1990;31:1

11、301,載體支架 的特點(diǎn),（1）生物相容性好 ；（2）細(xì)胞能夠正常生長(zhǎng)且形成近似體內(nèi)器官的正常結(jié)構(gòu) ；（3）具備角膜特有的透明，透光，透氧的特性 ；,目前常用的載體支架,1 羊膜 2 膠原 3 纖維蛋白4 脫細(xì)胞角膜基質(zhì) 5 甲殼素與殼聚糖,羊膜,當(dāng)胚體下沉，其周圍的外胚層和中胚層向上突起形成羊膜褶，頭褶、尾褶向上生長(zhǎng)，側(cè)褶向胚體背中部集中，最后，這些褶全部在胚體尾

12、端背部會(huì)合，將胚體全包在膜內(nèi)，內(nèi)層稱羊膜，羊膜腔內(nèi)有羊水，外層稱漿膜，這兩層膜在會(huì)合處形成漿羊膜縫。,,,,,,,生物羊膜,,羊膜的制備和保存,將胎盤取出后，立即在層流罩下用含50mg/L青霉素、50mg/L鏈霉素、100mg/L新霉素及25mg/L兩性霉素的平衡鹽溶液清洗表面凝血塊.從絨毛膜間的潛在腔隙中鈍性分離出羊膜，將其上皮面朝上，平鋪于0.45μm微孔硝酸纖維素膜上，切成3cm×4cm大小，儲(chǔ)藏于-80℃，含有Eagl

13、e基質(zhì)和甘油（1∶1）混合液的無(wú)菌瓶?jī)?nèi)備用。鑒于羊膜的制作和保存條件不足所帶來(lái)的醫(yī)用安全問題，滅菌生物羊膜已上市并投入使用.,,羊膜作為移植底物，是提供基質(zhì)，而不是移植上皮活細(xì)胞.羊膜中含有Ⅳ型膠原蛋白（與結(jié)膜中Ⅳ型膠原蛋白相同，可刺激杯狀細(xì)胞的分化）、整合素及板層體等多種成分，是結(jié)膜上皮化的合適附著物，為病變組織提供健康的上皮下基質(zhì)環(huán)境.,展望,理想人工角膜應(yīng)具有以下特點(diǎn)：①優(yōu)良的光學(xué)特性，穩(wěn)定的物理化學(xué)性質(zhì)。② 能夠與自體角膜組