低濃度哇巴因?qū)θ毖蹼嗍蠡讋?dòng)脈的調(diào)節(jié)作用.pdf

1、腦血管意外(CVA)或稱(chēng)腦卒中(Stroke)，已經(jīng)成為威脅人類(lèi)生命的第三大死因。約20％的病人會(huì)在一個(gè)月內(nèi)死亡，50％的幸存者也會(huì)留下嚴(yán)重的后遺癥，只有30％的病人恢復(fù)后可以獨(dú)立生活，但仍遺留有神經(jīng)方面的損傷。由于出血性腦卒中死亡率很高，所以CVA病人90％是缺血性腦卒中。 缺血性腦卒中主要是由于供氧不足引起的。大腦本身不能儲(chǔ)藏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其主要營(yíng)養(yǎng)來(lái)源有賴(lài)于腦部的血液循環(huán)。缺氧可以引起神經(jīng)元損傷、能量代謝障礙、和一些神經(jīng)癥狀，

2、可破壞血管的功能，且容易引起嚴(yán)重的腦出血。 作為維持細(xì)胞基本生理功能的關(guān)鍵酶，Na+，K+-ATP酶在缺氧中所發(fā)揮的作用越來(lái)越受到重視。當(dāng)缺氧發(fā)生時(shí)，ATP的合成發(fā)生障礙，從而抑制了Na+，K+-ATP酶離子泵的功能，使細(xì)胞內(nèi)鈉離子濃度升高，從而導(dǎo)致腦水腫；高濃度的鈉離子又可進(jìn)一步逆轉(zhuǎn)鈉鈣交換，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高，這是缺氧是細(xì)胞出現(xiàn)鈣超載的主要原因。 Na+，K+-ATP酶是否參與了豚鼠基底動(dòng)脈對(duì)于缺氧的肌原性

3、反應(yīng)的調(diào)節(jié)，此時(shí)所產(chǎn)生的肌原性反應(yīng)是否能夠?qū)谷毖跣允鎻?這是本試驗(yàn)首先所要闡明的問(wèn)題。其次，我們想證實(shí)低濃度哇巴因是否可以作用于Na+，K+-ATP酶，從而增強(qiáng)血管的肌原性反應(yīng)。 目的：采用微血管直徑測(cè)定儀，觀察哇巴因及缺氧對(duì)離體豚鼠基底動(dòng)脈直徑影響，從而研究豚鼠基底動(dòng)脈Na+，K+-ATP酶的特性，以及低濃度哇巴因是否通過(guò)Na+，K+-ATP酶對(duì)缺氧基底動(dòng)脈的直徑產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用。 方法：急性分離250g左右雄性豚鼠基底

4、動(dòng)脈，選擇無(wú)分支段0.5mm連同其前后各2mm血管，穿套于Pressure Myogragh System Model 120CP浴槽中兩根極細(xì)玻璃電極上，并結(jié)扎固定，管腔給予70mmHg壓力，并在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中持續(xù)向浴槽內(nèi)通入95％O2+5％CO2混合氣。穩(wěn)定一小時(shí)后分別采用表面灌流給藥，觀察不同濃度哇巴因?qū)﹄嗍蠡讋?dòng)脈直徑的影響，以探討缺氧對(duì)基底動(dòng)脈Na+，K+-ATP酶α亞基分布及其對(duì)哇巴因親和力的影響，1nM哇巴因?qū)﹄嗍蠡讋?dòng)脈缺氧

5、性舒張的影響、lnM哇巴因?qū)﹄嗍蠡讋?dòng)脈肌原性反應(yīng)的影響以及缺氧及低濃度哇巴因和缺氧對(duì)血管收縮劑K+-PSS作用的影響。 結(jié)果： 1.血管穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，完整內(nèi)皮和去內(nèi)皮的血管標(biāo)本制備完成后，持續(xù)以常氧PSS灌流60min，灌流前后其血管直徑變化分別為0.3±1.2μm和0.3±1.4μm，無(wú)顯著差異(P>0.05)，且當(dāng)間隔1小時(shí)前后分別給予40mM K+-PSS時(shí)，內(nèi)皮完整組血管收縮幅度分別為51

6、.1±5.8％和49.6±7.4％，而去內(nèi)皮組則為52.3±6.2％和49.8±6.5％(P>0.05)，二者之間無(wú)顯著性差別(P>0.05)，提示本實(shí)驗(yàn)條件下，豚鼠基底動(dòng)脈反應(yīng)活性至少可以保持60min。 2.缺氧對(duì)血管直徑的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)皮完整對(duì)照組血管經(jīng)常氧PSS灌流60min后，直徑增加0.3±1.2μm，而內(nèi)皮完整缺氧組血管經(jīng)無(wú)氧PSS灌流60min后，直徑增加4.8±1.7μm，增加幅度較對(duì)照組顯著為

7、大(P<0.01)。去內(nèi)皮對(duì)照組血管經(jīng)常氧PSS灌流60min后，直徑增加0.3±1.4μm，而去內(nèi)皮缺氧組血管經(jīng)無(wú)氧PSS灌流60min后，直徑增加5.2±1.9μm，增加幅度明顯大于去內(nèi)皮對(duì)照組(P<0.01)，但與內(nèi)皮完整缺氧組對(duì)比無(wú)顯著性差異(P>0.05)。提示在70mmHg壓力下，缺氧可引起豚鼠基底動(dòng)脈明顯舒張，且此舒張無(wú)內(nèi)皮依賴(lài)性。 3.低濃度哇巴因?qū)讋?dòng)脈缺氧性舒張的影響 從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，常氧對(duì)照組

8、血管灌流60min PSS后，血管直徑變化-0.2±1.2μm。單純?nèi)毖踅M血管預(yù)缺氧30min后繼續(xù)灌流無(wú)氧PSS 30min，血管直徑增加2.5±1.0μm，顯著強(qiáng)于常氧對(duì)照組(P<0.01)。哇巴因組血管預(yù)缺氧30min后，再灌流含10-9M哇巴因的無(wú)氧PSS 30min，血管直徑增加3.0±1.1μm，也顯著強(qiáng)于常氧對(duì)照組(P<0.01)，但與單純?nèi)毖踅M沒(méi)有明顯差別(P>0.05)，提示低濃度哇巴因并不影響缺氧所致豚鼠基底動(dòng)脈的舒

9、張反應(yīng)。 4.低濃度哇巴因?qū)θ毖趸讋?dòng)脈肌原性反應(yīng)的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，內(nèi)皮完整常氧組血管以含1nM哇巴因的PSS灌流30min時(shí)，由灌流0min時(shí)的333.5±23.43μm收縮至325.17±22.98μm，灌流60min時(shí)，收縮至323.33±22.93μm，均與灌流0min時(shí)的直徑有顯著差異(P<0.05)。當(dāng)內(nèi)皮完整缺氧組血管預(yù)先用1nM哇巴因灌流30min后，血管直徑則自灌流0min時(shí)的338.9±11.4μ

10、m收縮至329.6±13.3μm，有顯著性差異(P<0.05)，然后換用含1nM哇巴因的PSS繼續(xù)灌流使其缺氧30min后，血管進(jìn)而收縮至302.5±14.91μm，較灌流0min和30min時(shí)均有顯著性差異(P<0.05或0.01)，但去內(nèi)皮缺氧組的血管聯(lián)預(yù)先用1nM哇巴因孵育30min后，其直徑只自灌流0min時(shí)的337.0±19.2μm收縮至336.1±18.0μm，無(wú)顯著性差異(P>0.05)，繼續(xù)灌流含1nM哇巴因的無(wú)氧PSS

11、 30min后，也僅收縮至328.8±23.4μm與灌流0min和30min時(shí)均無(wú)顯著性差異(P>0.05)。這些結(jié)果提示，InM哇巴因單獨(dú)作用不僅可引起豚鼠基底動(dòng)脈收縮，也可明顯增強(qiáng)血管在缺氧狀態(tài)下的肌原性反應(yīng)，但是，后者只能發(fā)生在內(nèi)皮完整的血管，表現(xiàn)出明顯的內(nèi)皮依賴(lài)性。 5.低濃度哇巴因?qū)Ω哜浰氯毖趸讋?dòng)脈收縮作用的影響 對(duì)照組、缺氧組及哇巴因缺氧組血管經(jīng)高鉀液灌流時(shí)，均在4分鐘內(nèi)隨灌流時(shí)間延長(zhǎng)而收縮增強(qiáng)，灌流高鉀

12、液后第1、2、3、4分鐘時(shí)的血管收縮幅度，在對(duì)照組分別為30±17.8μm、54.4±21.9μm、68±23.7μm和72.8±25.1μm，在缺氧組分別為為40.6±16.9μm、74.8±22.7μm、86.8±21.9μm和83.6±23.4μm，且無(wú)氧灌流時(shí)血管直徑的變化曲線明顯左移。而哇巴因缺氧組分別為61.4±20.8μm、97.2±20.4μm、102.6±22.8μm和103.6±23.1μm，且無(wú)氧灌流時(shí)血管直徑的變

13、化曲線進(jìn)一步左移。提示，單純?nèi)毖蹼m然會(huì)引起血管舒張，但有收縮劑K±-PSS存在時(shí)，缺氧可以增加血管對(duì)收縮劑K±-PSS的敏感性，低濃度哇巴因可以進(jìn)一步增加缺氧血管對(duì)此收縮劑的敏感性。 6.缺氧對(duì)豚鼠基底動(dòng)脈Na+，K+-ATP酶α亞基親和力的影響 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不管是在常氧狀態(tài)下還是在缺氧狀態(tài)下，血管收縮幅度均隨哇巴因濃度升高而增大對(duì)AOD-OUA量效曲線以?xún)蓚€(gè)α亞基兩個(gè)結(jié)合位點(diǎn)模式進(jìn)行曲線擬合，可得到兩條最佳擬合曲線，

14、其結(jié)果提示，無(wú)論在常氧狀態(tài)下還是在缺氧狀態(tài)下，豚鼠基底動(dòng)脈的Na+，K+-ATP酶既存在高親和力α亞基(α2和或α3亞基)，也存在低親和力α亞基(α1亞基)。所不同的是，在常氧情況下，高親和力α亞基與哇巴因結(jié)合的kD值為5.3×10-10M，低親和力α亞基的kD值為1.26×10-6M；而在缺氧情況下，高親和力α亞基的kD值為1.57×10-7M，低親和力α亞基的kD值為9.89×10-6 M。由以上結(jié)果可知，缺氧可明顯降低豚鼠基底動(dòng)脈

15、Na+，K+-ATP酶α亞基結(jié)合哇巴因的親和力，且對(duì)高親和力α亞基的影響較低親和力α亞基更為明顯，其中缺氧可使豚鼠基底動(dòng)脈Na+，K+-ATP酶高親和力α亞基對(duì)哇巴因的親和力降低約500倍；使低親和力α亞基的親和力僅降低8倍。 結(jié)論：缺氧可引起豚鼠基底動(dòng)脈明顯舒張，且此舒張無(wú)內(nèi)皮依賴(lài)性，但是缺氧卻可以增加血管對(duì)于收縮劑K+-PSS的反應(yīng)性。1nM哇巴因不影響豚鼠基底動(dòng)脈的缺氧性舒張，但可以增強(qiáng)血管的肌原性反應(yīng)以及缺氧血管對(duì)收縮劑