MAPEG在胚胎干細(xì)胞衍生肝組織及胚胎器官發(fā)育中的表征.pdf

1、第一部分：MAPEG在小鼠胚胎干細(xì)胞體外衍生肝組織發(fā)育依賴性表征目的:探索MAPEG在mES細(xì)胞體外衍生肝組織模型表征,旨在為揭示其在肝臟體外發(fā)育過程生命現(xiàn)象本質(zhì)提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)依據(jù)并探討潛在的應(yīng)用前景。方法:1.采用mES細(xì)胞分化技術(shù),構(gòu)建mES細(xì)胞衍生肝組織模型。RT-PCR法檢測mES細(xì)胞未分化基因OCT4、心肌細(xì)胞特異性基因(MLC-2V)、肝細(xì)胞發(fā)育依賴性基因(AFP、HNF3β、ALB、CYP7al、G6P)、內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物

2、血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附因子(PECAM-1)表達(dá)情況;細(xì)胞免疫化學(xué)鑒定肝細(xì)胞特異性標(biāo)記物白蛋白(ALB),心肌特異性標(biāo)記物肌鈣蛋白(Troponin T),內(nèi)皮細(xì)胞特征性蛋白(PECAM-1); ELISA法考察衍生肝組織白蛋白合成分泌功能。2. RT-PCR測定該模型中MAPEG家族mRNA表達(dá);Western blot和免疫細(xì)胞化學(xué)方法考察MAPEG家族蛋白表達(dá);采用MGST1與底物GSH和CDNB的催化實(shí)驗(yàn)來測定衍生肝組織MGST1

3、的催化活性;采用過氧化亞硝基陰離子(ONOO-)與衍生肝組織MGST1共孵育,后用Western blot檢測MGST1是否以蛋白二聚體形式被修飾激活。結(jié)果:1.mES細(xì)胞體外衍生肝組織鑒定:(1)細(xì)胞形態(tài)學(xué):呈雙核成熟肝細(xì)胞表型區(qū)域附近伴有節(jié)律性收縮心肌細(xì)胞共存;(2)基因轉(zhuǎn)錄層面:發(fā)育依賴性表達(dá)特征如下:多潛能基因OCT4逐漸減弱,心肌細(xì)胞特異性基因MLC-2V、內(nèi)皮細(xì)胞特異性基因PECAM-1依此增強(qiáng),肝細(xì)胞特異性基因AFP先上升

4、后消失、HNF3β、ALB、CYP7al、G6P發(fā)育依賴性表達(dá)增強(qiáng);(3)蛋白翻譯層面:該衍生肝組織發(fā)育依賴性表達(dá)肝、心肌、內(nèi)皮細(xì)胞特征性蛋白ALB、Troponin T和PECAM-1。(4)白蛋白分泌功能:該衍生肝組織細(xì)胞培養(yǎng)液中白蛋白分泌量在分化過程中逐漸增加,至D18開始達(dá)峰值并趨于平緩。較原代培養(yǎng)肝細(xì)胞維持時(shí)間長且處于較高水平。2.MAPEG家族基因轉(zhuǎn)錄層面表征:除MGST3在分化過程中維持恒定表達(dá),MAPEG家族其他5個(gè)成員

5、均在mRNA水平隨著mES細(xì)胞體外衍生肝組織分化成熟呈發(fā)育依賴性增強(qiáng)。3.MAPEG家族蛋白翻譯層面表征:6個(gè)蛋白存在不同表達(dá)模式,MGST1蛋白在分化D14出現(xiàn),隨著分化進(jìn)行逐漸增強(qiáng);LTC4S和mPGES-1在整個(gè)分化過程中呈發(fā)育依賴性遞減,而FLAP蛋白在分化過程中維持恒定表達(dá);MGST2和MGST3均未檢測到蛋白表達(dá)。4.MGST催化功能和修飾激活特征:分化D18衍生肝組織MGST1的催化活性為7.65 nmol/min/mg;

6、但此時(shí)衍生肝組織MGST1和胎鼠E18肝(見陰栓之日記為E0)MGST1一樣,均不能被活性氮如ONOO-以蛋白二聚體的形式修飾激活。結(jié)論:1. MAPEG在mES細(xì)胞體外衍生肝組織中均具有基因轉(zhuǎn)錄基礎(chǔ);蛋白表達(dá)未完全相一致的現(xiàn)象,既可能與肝組織功能尚未完善相關(guān),也可能與該類蛋白為功能蛋白,僅在需要時(shí)瞬時(shí)表達(dá)相關(guān)。且提示該模型可望用于花生四烯酸相關(guān)的炎癥通路研究。2.mES細(xì)胞體外衍生肝組織MGST1具有催化功能,但未能被活性氮以二聚體形

7、式修飾激活,該特征與小鼠胚胎肝組織來源MGST1相一致。提示該衍生肝組織MGST1不具備在親電子物質(zhì)侵襲過程修飾激活而增強(qiáng)解毒功能的特性。3.mES細(xì)胞體外衍生肝組織模型具有成熟肝細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞表型,發(fā)育依賴性表達(dá)肝細(xì)胞特征性基因,并具備白蛋白合成分泌功能。該模型可望用于體外肝臟發(fā)育學(xué)、肝臟生理病理學(xué)、肝組織代謝、藥理毒理學(xué)評價(jià),乃至再生醫(yī)學(xué)細(xì)胞移植和組織工程等研究。第二部分MAPEG在大鼠胚胎器官形成過程中的表達(dá)特征目的:MAPE

8、G廣泛分布于腎、肺和腦等多種器官組織。因小鼠早期胚胎各器官體積過小而存在取材困難,大鼠和小鼠同屬嚙齒類動(dòng)物,具有較好的類比性,本部分進(jìn)一步探索MAPEG家族在大鼠胚胎發(fā)育過程中,腦、心、肺、肝和腎等主要組織表達(dá)特征,為揭示該家族的體內(nèi)發(fā)育生物學(xué)本質(zhì)和意義提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:1.收集SD大鼠E14、E16、E18、E20、新生大鼠、成年大鼠腦、心、肺、肝、腎5個(gè)組織(陰道查得精子之日為E0)。2.RT-PCR測定各組織發(fā)育過程中MAPEG

9、家族各成員mRNA表達(dá)。3. Western blot和免疫組織化學(xué)法考察MAPEG家族相應(yīng)蛋白表達(dá)。4.MGST1與底物GSH和CDNB催化實(shí)驗(yàn)來測定MGST1催化活性;ONOO-與胚胎MGST1共孵育,后用Western blot檢測MGST1是否在體外以蛋白二聚體形式被修飾激活。HPLC法分別檢測白三烯合成酶系和mPGE-1催化功能。結(jié)果:1.MAPEG家族基因轉(zhuǎn)錄層面表達(dá)模式:除MGST2未在胎肺組織中檢測到,其余5個(gè)成員均可在

10、胎鼠腦、心、肝、腎組織中檢測到,并呈不同程度發(fā)育依賴性表達(dá)特征。2.MAPEG家族蛋白翻譯層面表達(dá)模式:MGST1在胎肝、肺組織中發(fā)育依賴性遞增,在胎腦組織中則表達(dá)呈發(fā)育依賴性遞減,而在胎心、腎組織中未見表達(dá)。除胎肺組織之外,MGST2在E18胎鼠其他4個(gè)組織均有表達(dá)。MGST3和LTC4S在各器官形成過程中呈發(fā)育依賴性增加。FLAP在胎腦、心、腎發(fā)育過程中表達(dá)逐漸增強(qiáng),而在胎肝、肺組織中表達(dá)先增強(qiáng)后減少,分別在E16和E18達(dá)表達(dá)高峰

11、后下調(diào)。mPGES-1在腦和肝組織中發(fā)育依賴性遞減,而心臟組織中mPGES-1表達(dá)從E14至E18逐漸遞增,后逐漸下降。但在肺和腎中呈發(fā)育依賴性遞增。此外,MGST3、LTC4S、FLAP和mPGES-1在胚胎期表達(dá)均高于成年期。3.MGST1催化功能和修飾激活特征:胎肝MGST1催化活性發(fā)育依賴性增強(qiáng),但弱于成年期。胎腦和胎肺MGST催化活性未呈發(fā)育依賴性變化,且活性均低于胎肝。胎肝MGST1能被ONOO-以蛋白二聚體形式修飾激活,而

12、胎肺MGST1不能被修飾激活。4.白三烯合成酶系催化功能:5個(gè)組織中白三烯合成酶系均具有合成LTC4能力,且呈發(fā)育依賴性增強(qiáng),但均弱于成年大鼠相應(yīng)組織。除了胎肺,MGST2均參與了催化LTC4的合成。5.mPGES-1催化功能考察:在胚胎肝和腦發(fā)育過程中mPGES-1催化能力逐漸減弱,而其他組織中催化能力則逐漸增強(qiáng)。結(jié)論:1. MAPEG在大鼠胚胎器官形成過程中具有器官分布特異性和不同發(fā)育依賴性表征,可能與不同器官功能需求差異和形成完善

13、相關(guān),也可能與該類蛋白為功能蛋白,僅受特定條件下調(diào)控表達(dá)相關(guān)。且提示大鼠胚胎器官具備花生四烯酸相關(guān)炎癥通路的物質(zhì)基礎(chǔ)。2.大鼠胎肝MGST1具備催化親電子物質(zhì)與谷胱甘肽結(jié)合功能,且可被活性氮以蛋白二聚體形式修飾激活。大鼠胎肺和小鼠胎肝MGST1則不能被活性氮修飾激活,提示MGST1修飾激活特性具有組織和種屬專屬性。3.LTC4合成酶系在大鼠胚胎5個(gè)組織中蛋白表達(dá)與催化活性均呈發(fā)育依賴性遞增,且除胎肺外,其他組織MGST2均參與了催化LT