高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化痰瘀證候的蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化屬于中醫(yī)“痰濁”、“血瘀”范疇，痰濁血瘀是高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化的重要病機(jī)早已成為共識(shí)，高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化痰瘀證候可能是機(jī)體在血漿蛋白質(zhì)水平發(fā)生了某些改變產(chǎn)生的后果，這些發(fā)生改變的蛋白質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化、高脂血癥等疾病密切相關(guān)。尋找發(fā)生改變的蛋白質(zhì)與高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化痰瘀證候的關(guān)系，將有利于深刻揭示痰瘀證候的生化基礎(chǔ)和病因病機(jī)。 本研究以國家自然基金資助的“有關(guān)中醫(yī)藥幾個(gè)關(guān)鍵問題”之一的“高脂血癥及動(dòng)

2、脈粥樣硬化痰瘀證候的蛋白質(zhì)組學(xué)”課題為依托，把中醫(yī)的基礎(chǔ)理論與前沿的現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)相結(jié)合，對(duì)證候在蛋白質(zhì)表達(dá)水平上的變化及可能的差異蛋白質(zhì)與證候各種影響因素的相關(guān)性進(jìn)行了深入的探討。 方法 1.采集符合條件的146例高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化痰證、瘀證、痰瘀互阻證和非痰非瘀類證候(其他證型)患者及37例健康對(duì)照的血漿樣品，采用GE公司的IPGphor等電聚焦儀、DALTSIX垂直電泳儀等儀器進(jìn)行雙向電泳。 2.利用GE

3、公司的圖像分析軟件ImagmAster2-DEplatinum6.0對(duì)血漿樣品的凝膠圖譜進(jìn)行分析。 3.利用Fisher判別法篩選差異蛋白質(zhì)的典型成分及圖模型分析方法對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行相關(guān)性分析。 結(jié)果 1.雙向電泳實(shí)驗(yàn)獲得的電泳圖譜經(jīng)軟件分析，對(duì)變異度在70﹪以上的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行分析，得到以下幾方面的結(jié)果： (1)有31種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)可能是高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化的標(biāo)志蛋白質(zhì)群，其中有18種蛋白表達(dá)量較

4、正常人呈現(xiàn)上調(diào)趨勢(shì)，13種蛋白表達(dá)量呈現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)。 (2)上述31種高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化的標(biāo)志蛋白在痰瘀類證候中有16種蛋白表達(dá)量較非痰非瘀類證候呈現(xiàn)升高趨勢(shì)，15種蛋白表達(dá)量呈降低趨勢(shì)。 (3)31個(gè)差異蛋白質(zhì)中，表達(dá)量最低的蛋白質(zhì)分布，非痰非瘀類證候5個(gè)，痰證3個(gè)，瘀證8個(gè)；痰瘀互阻證8個(gè)，其中包含2個(gè)瘀證特有的標(biāo)志蛋白，僅包含1個(gè)痰證的標(biāo)志性蛋白。表達(dá)量最高的蛋白質(zhì)分布，非痰非瘀類證候9個(gè)，痰證7個(gè)，瘀證6個(gè)；痰

5、瘀互阻證5個(gè)，其中包含2個(gè)瘀證特有的蛋白質(zhì)和1個(gè)痰證特有的蛋白質(zhì)。 (4)可能標(biāo)志高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化證候相互關(guān)系及演變規(guī)律的蛋白質(zhì)(如下表，括號(hào)內(nèi)數(shù)字為凝膠上蛋白質(zhì)的ID) 2.對(duì)上述差異蛋白質(zhì)進(jìn)一步篩選，對(duì)變異度在100﹪以上的11個(gè)蛋白質(zhì)進(jìn)行Fisher判別和相關(guān)性分析。篩選能夠區(qū)分兩組間具有顯著性差異的典型成分，選擇對(duì)該典型成分貢獻(xiàn)大的蛋白質(zhì)作為可能區(qū)分兩組的標(biāo)志蛋白。發(fā)現(xiàn)： (1)區(qū)分正常和高脂血癥及

6、動(dòng)脈粥樣硬化病人的標(biāo)志蛋白質(zhì)為：1481、1521； (2)區(qū)分非痰非瘀類證候與痰瘀類證候可能的標(biāo)志蛋白質(zhì)為：1383、1635； (3)區(qū)分痰證和瘀證可能的標(biāo)志蛋白質(zhì)為：1521、1563、1688、1666； (4)區(qū)分痰證和痰瘀互阻證可能的標(biāo)志蛋白質(zhì)為：1481、1539、1635； (5)區(qū)分瘀證和痰瘀互阻證可能的標(biāo)志蛋白質(zhì)為：1456、1563。 3.標(biāo)志蛋白與臟腑功能及其他因素的關(guān)系

7、 (1)分析高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化病人可能的兩個(gè)標(biāo)志性蛋白質(zhì)1521、1481群的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)兩者與臟腑功能均不相關(guān)，1521與TG、HDL、內(nèi)膜厚度、既往高血壓，動(dòng)脈粥樣硬化之間存在相關(guān)性，與其余因素均無關(guān)；1481與LDL、C反應(yīng)蛋白、動(dòng)脈粥樣硬化病史相關(guān)，與其余因素均無關(guān)。 (2)分析痰瘀類證候的兩個(gè)標(biāo)志蛋白質(zhì)1383、1635群的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)1383與腎氣虛、TC、HDL、LDL、AI、內(nèi)膜厚度及斑塊面積、既往動(dòng)脈

8、粥樣硬化、家族史及用藥情況、運(yùn)動(dòng)情況存在相關(guān)性；1635與腎氣虛及心氣虛、C反應(yīng)蛋白、既往動(dòng)脈粥樣硬化存在相關(guān)性。 (3)分析區(qū)分痰證和瘀證的主要標(biāo)志蛋白質(zhì)1521、1563、1666、1688，發(fā)現(xiàn)1521與腎氣虛、TC、TG、AI、切變率為30的血液黏度、用藥情況、吸煙及飲酒情況；1563與心氣虛、腎氣虛、管腔內(nèi)徑，內(nèi)膜厚度，斑塊面積、切變率為30的血液黏度、既往高血壓及動(dòng)脈粥樣硬化、用藥情況、吸煙及飲酒情況存在相關(guān)性；16

9、66與心氣虛、腎氣虛、內(nèi)膜厚度、用藥情況、吸煙及飲酒情況存在相關(guān)性，與其余指標(biāo)均無關(guān)。1688與與臟腑功能關(guān)系不大，與既往高血壓及動(dòng)脈粥樣硬化、用藥情況、吸煙及飲酒情況存在相關(guān)性。 (4)分析區(qū)分痰證、痰瘀互阻證的主要標(biāo)志蛋白質(zhì)1481、1539、1635，發(fā)現(xiàn)1481與心氣虛、腎氣虛及脾氣虛、AI、C反應(yīng)蛋白、切變率為5時(shí)的血液黏度、PLT、家族史、吸煙及飲酒情況之間存在著直接的相互關(guān)系；1539與心氣虛、腎氣虛及脾氣虛、TC

10、、C反應(yīng)蛋白、管腔內(nèi)徑、纖維蛋白原、切變率為1、5、200時(shí)的血液黏度、體重指數(shù)、既往高血壓及動(dòng)脈粥樣硬化、家族史、用藥情況、吸煙及飲酒情況等方面存在相關(guān)性。1635與心氣虛、腎氣虛及脾氣虛、切變率為1、200時(shí)的血液黏度、PLT、家族史等方面存在相關(guān)性。 (5)分析區(qū)分瘀證、痰瘀互阻證的兩個(gè)標(biāo)志蛋白質(zhì)1456，1563與各因素的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)1456與心氣虛、腎氣虛及脾氣虛、內(nèi)膜厚度、切變率為1時(shí)的血液黏度、纖維蛋白原及紅細(xì)胞壓

11、積、家族史、運(yùn)動(dòng)情況、吸煙及飲酒情況之間存在相關(guān)性；1563與脾氣虛、切變率為5和30時(shí)的血液黏度、HGB及HCT、既往動(dòng)脈粥樣硬化病史、用藥情況、吸煙及飲酒情況之間存在相關(guān)性。 結(jié)論 1.首次將血漿蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)用于高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化痰瘀證候研究。 2.首次將Fisher判別分析篩選典型成分方法和圖模型的分析方法應(yīng)用于判別痰瘀證候的典型成分，分析其與不同影響因素的相關(guān)性。 3.疾病和正常之間及不同痰

12、瘀證候之間在蛋白質(zhì)組水平上存在蛋白表達(dá)差異，并且差異表達(dá)的蛋白質(zhì)在痰瘀證候之間存在一定的變化規(guī)律。 4.痰證、瘀證和痰瘀互阻證三種不同證候分別有其可能標(biāo)志蛋白群。其中痰瘀互阻證的標(biāo)志蛋白群中包含部分痰證和血瘀證的標(biāo)志蛋白，且血瘀證占的比例高于痰證，表明本項(xiàng)研究中的痰瘀互阻證是以瘀證為主兼夾痰證。 5.對(duì)痰瘀證候間的相互關(guān)系及變化規(guī)律分析，發(fā)現(xiàn)絕大部分差異表達(dá)蛋白質(zhì)都隨著由非痰非瘀證—痰證—瘀證—痰瘀互阻證或由痰證—瘀證—

13、痰瘀互阻，以及由非痰非瘀證—痰證—瘀證的傳變過程，呈現(xiàn)有規(guī)律性表達(dá)量升高或降低趨勢(shì)，這種變化規(guī)律揭示了臨床上的痰瘀變化規(guī)律主要是由痰致瘀這一事實(shí)。 對(duì)2-DE凝膠通過分析軟件獲得的高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化不同痰瘀證候差異蛋白質(zhì)表達(dá)譜應(yīng)用Fisher典型分析方法和圖模型等方法分析取得如下幾方面重要發(fā)現(xiàn)： 1.高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化病人血漿中標(biāo)志蛋白群為：1521、1481。 2.高脂血癥及動(dòng)脈粥樣硬化痰瘀類證候血漿中

14、標(biāo)志蛋白群為：1383、1635。 3.痰證血漿中標(biāo)志蛋白群為：1481、1539、1635。 4.瘀證血漿中標(biāo)志蛋白群為：1521、1563、1666、1688。 5.痰瘀互阻證血漿中標(biāo)志蛋白群為：1456、1563。 6.區(qū)分不同證候間的可能標(biāo)志蛋白與臟腑功能間存在不同的相關(guān)性，其中與痰瘀類(包括痰證、瘀證及痰瘀互阻證)相關(guān)的標(biāo)志蛋白質(zhì)主要與心氣虛及腎氣虛有關(guān)；與痰證相關(guān)的標(biāo)志蛋白質(zhì)主要與心氣虛、腎氣

15、虛及脾氣虛有關(guān)；與瘀證相關(guān)的標(biāo)志蛋白主要與心氣虛及腎氣虛有關(guān)；與痰瘀互阻證相關(guān)的標(biāo)志蛋白質(zhì)主要與腎氣虛及心氣虛有關(guān)，脾氣虛次之。 7.不同臟腑功能相關(guān)的標(biāo)志蛋白與血脂及脂蛋白代謝、CRP、血液流變學(xué)參數(shù)、血管壁受損程度、用藥及疾病史、煙酒嗜好、運(yùn)動(dòng)等因素作進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)： 7.1痰瘀類證候的標(biāo)志蛋白群中 與腎氣虛相關(guān)的標(biāo)志蛋白1383表達(dá)量的升高與TC、HDL、LDL、AI、內(nèi)膜厚度及斑塊面積、既往動(dòng)脈粥樣硬化

16、、家族史及用藥、運(yùn)動(dòng)情況存在相關(guān)性；與腎氣虛及心氣虛相關(guān)的標(biāo)志蛋白1635表達(dá)量的降低與C反應(yīng)蛋白、既往動(dòng)脈粥樣硬化存在相關(guān)性； 7.2痰證的標(biāo)志蛋白群中 與心氣虛、腎氣虛及脾氣虛相關(guān)的標(biāo)志蛋白1481表達(dá)量的升高與AI、C反應(yīng)蛋白、切變率為5時(shí)的血液黏度、PLT、家族史、吸煙及飲酒情況之間存在相關(guān)性。 與心氣虛、腎氣虛及脾氣虛相關(guān)的標(biāo)志蛋白1539表達(dá)量的降低與TC、C反應(yīng)蛋白、管腔內(nèi)徑、纖維蛋白原、切變率為1

17、、5、200時(shí)的血液黏度、體重指數(shù)、既往高血壓及動(dòng)脈粥樣硬化、家族史、用藥情況、吸煙及飲酒情況等方面存在相關(guān)性。 與心氣虛、腎氣虛及脾氣虛相關(guān)的標(biāo)志蛋白1635表達(dá)量的降低與切變率為1及200時(shí)的血液黏度、PLT、家族史等方面存在相關(guān)性。 7.3瘀證的標(biāo)志蛋白群中 與腎氣虛相關(guān)的標(biāo)志蛋白1521表達(dá)量的降低與TC、TG、AI、切變率為30的血液黏度、用藥情況、吸煙及飲酒情況存在相關(guān)性。 與心氣虛、腎氣虛相