人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7基因強化的組織工程骨的構建及對兔骨缺損修復作用研究.pdf

1、目的：創(chuàng)傷、感染、腫瘤、先天性疾病等原因所致的骨缺損臨床常見。組織工程骨兼有骨誘導性和骨傳導性，且可根據(jù)需要制成不同的形狀，為臨床治療大段骨缺損帶來希望。但是組織工程研究中，細胞因子無論是從天然生物中提純，還是用基因工程表達，均存在程序復雜，產(chǎn)量低，活性不穩(wěn)定等缺點，因此如何有效發(fā)揮細胞生長因子適時、適量效用，利用細胞與基質材料特異性黏附，細胞增殖，定向分化，發(fā)揮正常的生理功能，以實現(xiàn)最終理想的功能替代，一直是組織工程研究的難點與熱點，

2、基因工程技術與組織工程的結合為以上問題的解決提供了可供選擇的良好辦法。 目前BMP-7重組蛋白及醫(yī)用硫酸鈣已商品化。本實驗以醫(yī)用硫酸鈣為支架材料，轉染人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7(BMP-7)基因的骨髓基質細胞(BMSCs)作為種子細胞，體外構建基因強化的組織工程骨，并研究該組織工程骨對骨缺損的治療作用。希望能為骨缺損的治療提供實驗和理論依據(jù)。 方法： 1.BMP-7基因重組腺病毒載體(Ad.BMP-7)的構建抽提人胎腎

3、組織總mRNA，經(jīng)RT-PCR合成rBMP-7基因，繼而再將其插入帶有腺病毒基因組的、擴增后挑選插入方向正確的克隆。在脂質體介導下，用攜帶目的基因的粘粒載體pAxcAwt.BMP-7與腺病毒基因組末端蛋白DNA-TPC共同轉染293細胞，制備重組腺病毒。通過對重組腺病毒DNA進行PCR檢測及酶切鑒定，將鑒定好的病毒克隆進一步擴增、純化和測定滴度。 2.髓基質細胞體外的分離、培養(yǎng)以及Ad.BMP-7體外轉染骨髓基質細胞后的表達采用

4、密度梯度離心法與貼壁篩選法聯(lián)合體外分離、培養(yǎng)兔骨髓基質細胞(BMSCs)，觀察原代及傳代細胞的生長發(fā)育情況，并繪制生長曲線。Ad.BMP-7轉染BMSCs，使用熒光顯微鏡和免疫組化方法檢測BMP-7蛋白在細胞中的表達。 3.體外構建BMP-7基因強化的組織工程骨將第三代骨髓基質細胞和轉染BMP-7基因的骨髓基質細胞分別與硫酸鈣材料在體外復合培養(yǎng)，通過消化法、倒置相差顯微鏡和掃描電鏡觀察細胞在材料上的黏附情況，繪制細胞生長曲線。

5、 4.基因強化的組織工程骨對骨缺損修復的動物實驗60只新西蘭大白兔隨機分為A、B和C三組，每組20例。A組在骨缺損處植入BMP-7基因+BMSCs+醫(yī)用硫酸鈣材料，B組在骨缺損處植入BMSCs+醫(yī)用硫酸鈣材料，C組單純植入醫(yī)用硫酸鈣。分別在術后4、8和12周取材，通過大體觀察、影像學、組織學和生物力學等方法觀察實驗動物骨缺損的修復情況。 結果： 1.提取的RNA完整，純度高。RT-PCR合成的DNA片段經(jīng)克隆、測序

6、后確證為目的基因(BMP-7基因)，插入粘粒載體pAxCAwt后獲得高滴度重組腺病毒(108pfu/ml)。 2.培養(yǎng)獲得了高純度的兔骨髓基質細胞(BMSCs)。骨髓基質細胞轉染Ad.aBMP-7后72小時熒光顯微鏡可見綠色熒光蛋白表達，細胞免疫組化結果顯示細胞內(nèi)有BMP-7蛋白的表達。 3.骨髓基質細胞及轉染BMP-7基因的骨髓基質細胞在硫酸鈣表面均有生長，且隨著復合培養(yǎng)時間的延長，材料上細胞的數(shù)量也隨之增長。

7、 4.影像學、病理學及生物力學檢測結果：BMP-7基因修飾的組織工程骨在植入動物骨缺損區(qū)后，能更快地修復骨缺損。 結論： 1.DNA末端蛋白復合物可使重組腺病毒的制備效率大大提高，降低野生型腺病毒出現(xiàn)的概率。重組腺病毒滴度高、純度好、毒性低。 2.我們構建的攜帶BMP-7基因的腺病毒載體，能高效轉染培養(yǎng)的骨髓基質細胞。后者能夠表達、分泌BMP-7蛋白。 3.成功構建BMP-7基因強化的組織工程骨。