人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增及鼠腦移植對(duì)腦血管再生影響.pdf

1、背景:缺血缺氧性腦損傷(Hypoxic-ischemicbraindamage)是臨床上新生兒致殘的最主要原因，其致死率致殘率達(dá)47％，存活患兒中有1/3留有不同程度的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥。由于神經(jīng)細(xì)胞有限的再生功能，腦損傷后的治療是目前臨床上的難點(diǎn)。近年來(lái)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，血液系統(tǒng)來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞具有不可思議的可塑性，可以向骨、軟骨、脂肪、肌肉、甚至神經(jīng)等組織器官組成細(xì)胞分化，骨髓及臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞有望成為腦損傷細(xì)胞移植治療的一個(gè)重要細(xì)胞來(lái)源。

2、因此，有關(guān)血液系統(tǒng)來(lái)源干細(xì)胞在神經(jīng)系統(tǒng)修復(fù)的價(jià)值日益成為熱點(diǎn)。近幾年來(lái)，陸續(xù)有研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞移植后對(duì)大鼠運(yùn)動(dòng)學(xué)習(xí)功能有所改善、外源性的間充質(zhì)干細(xì)胞能夠在動(dòng)物腦內(nèi)定植及表達(dá)神經(jīng)細(xì)胞相關(guān)抗原。此方面的研究雖然在近年來(lái)有了長(zhǎng)足進(jìn)步，但臨床前的基礎(chǔ)研究沒(méi)有完善，仍存在許多問(wèn)題：如外源細(xì)胞是否能在動(dòng)物模型代替原來(lái)細(xì)胞并發(fā)揮功能、是否通過(guò)其他途徑促進(jìn)動(dòng)物模型腦損傷修復(fù)等。 目的:本研究目的是從人胎兒臍血中分離出間充質(zhì)干細(xì)胞并培養(yǎng)擴(kuò)增，

3、對(duì)其進(jìn)行鑒定。通過(guò)腦室注射移植給HIBD大鼠，觀察其對(duì)大鼠影響。1.從新生兒臍帶中收集臍帶血，體外增擴(kuò)培養(yǎng)并鑒定其中間充質(zhì)干細(xì)胞。2.通過(guò)體外誘導(dǎo)確定其向神經(jīng)細(xì)胞方向分化能力。3.通過(guò)腦室內(nèi)注射間充質(zhì)干細(xì)胞方法，觀察其在模型鼠體內(nèi)定植及血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子表達(dá)影響。 方法:1.臍帶血的采集備好肝素抗凝注射器，肝素濃度約20U/ml。胎兒娩出后(胎盤(pán)仍在宮腔內(nèi))，在距胎兒臍輪5～7cm的臍帶處進(jìn)行雙結(jié)扎，剪斷臍帶。在產(chǎn)婦端盡量靠近

4、胎盤(pán)處選擇粗大顯露的臍靜脈，碘伏消毒后用含肝素的50ml注射器穿刺臍靜脈抽取20～50ml臍帶血液。采血時(shí)盡量讓注射器低于產(chǎn)婦外陰，使胎盤(pán)血可以順利流出，采集完畢及時(shí)用止血鉗夾緊。 2.臍帶血MNCs分離、培養(yǎng)擴(kuò)增及鑒定以Ficoll-Hypaque(淋巴細(xì)胞分離液，d=1.077g/ml)作為細(xì)胞分離的離心介質(zhì)，等密度梯度離心法分離出臍血單個(gè)核細(xì)胞，置于DMEM+20％FBS+100U/ml青霉素+100U/ml鏈霉素培養(yǎng)基培

5、養(yǎng)，結(jié)合貼壁法棄去未貼壁細(xì)胞，純化出間充質(zhì)干細(xì)胞(hUCB-MSCs)。取第3代傳代細(xì)胞行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。 3.細(xì)胞誘導(dǎo)分化及細(xì)胞免疫組織化學(xué)傳至第3代MSCs細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度5×103/ml種于含蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，于含20％FBS+DMEM/5mmol/L巰基乙醇(BME)培養(yǎng)基中預(yù)誘導(dǎo)24小時(shí)。置于含DMEM/2％DMSO/200umol/LBHA的無(wú)血清誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)。分別于加入誘導(dǎo)劑后第1d及第5d，取長(zhǎng)有細(xì)

6、胞的蓋玻片，免疫細(xì)胞化學(xué)染色。 4.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)97只7日齡SD大鼠，性別不拘，按照隨機(jī)數(shù)字表法分為HIBD組(31只)、治療組(32只)及空白對(duì)照(34只)3組。7日齡新生大鼠，不分雌雄，動(dòng)物置于手術(shù)臺(tái)上，碘伏消毒頸前正中切口部位，沿頸正中切開(kāi)皮膚，鈍性分離皮下組織和肌肉。左頸動(dòng)脈三角處分開(kāi)胸鎖乳突肌，在深部可以看見(jiàn)搏動(dòng)的左頸動(dòng)脈。分離血管與周?chē)M織，用4.0號(hào)絲線在兩端結(jié)扎血管并離斷。術(shù)后新生鼠清醒后放入含8％O2缺氧裝置缺氧2

7、小時(shí)。傳至第3代Brdu標(biāo)記臍血間充質(zhì)細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞計(jì)數(shù)約1×106/ml，所有動(dòng)物均于造模后即予腦室內(nèi)注射細(xì)胞(1×104/只)，操作完成后將大鼠放回母鼠繼續(xù)喂養(yǎng)。 5.免疫組織化學(xué)檢測(cè)分別于細(xì)胞干預(yù)后第1、3、7、14天處死動(dòng)物并取腦組織，石蠟包埋并切片行免疫組化檢測(cè)血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(VEGF)在腦內(nèi)的表達(dá)及MSCs的在腦內(nèi)的分布情況。 6.統(tǒng)計(jì)方法本實(shí)驗(yàn)采用SPSS11.5統(tǒng)計(jì)軟件，方差分析及χ2檢驗(yàn)方法進(jìn)行檢

8、驗(yàn)。 [結(jié)果]1.含有20％FBS/DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)臍血來(lái)源單個(gè)核細(xì)胞，從48h開(kāi)始通過(guò)每天全量換液逐漸除去不貼壁細(xì)胞，至1周左右可見(jiàn)貼壁細(xì)胞呈單個(gè)分散或數(shù)個(gè)細(xì)胞克隆，細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始呈現(xiàn)長(zhǎng)梭形，形態(tài)較均一。培養(yǎng)至45天左右細(xì)胞可達(dá)80％～90％融合，傳代后細(xì)胞形態(tài)單一，生長(zhǎng)明顯加快。 2.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果取臍血等密度梯度離心后分離的MNCs，PBS洗滌兩遍，重懸后做流式細(xì)胞分析，作為對(duì)照組。結(jié)果顯示與臍血的MNCs中C

9、D34+細(xì)胞占絕大多數(shù)，說(shuō)明從臍血分離的MNCs中主要含有造血干細(xì)胞特征的細(xì)胞為主。經(jīng)過(guò)貼壁培養(yǎng)傳代后的細(xì)胞hUCB-MSCs，傳至第三代收集后做流式細(xì)胞分析，結(jié)果顯示以CD34-細(xì)胞為主，表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞相關(guān)表面抗原，如CD44。 3.顯微鏡下可見(jiàn)誘導(dǎo)分化前的臍帶血間充質(zhì)干細(xì)胞大部分呈較均一梭形，加入預(yù)誘導(dǎo)培養(yǎng)基后細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化，培養(yǎng)基中加入DMSO及BHA后大約6小時(shí)內(nèi)，光鏡下可觀察到細(xì)胞形態(tài)開(kāi)始變化，于誘導(dǎo)前、誘導(dǎo)后第

10、1、5天觀察Nestin、NF-M陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)比例(在誘導(dǎo)前細(xì)胞Nestin及NF-M表達(dá)皆處于非常低狀態(tài)，加入誘導(dǎo)劑在，在第1d時(shí)可見(jiàn)Nestin陽(yáng)性急劇增多，NF-M陽(yáng)性細(xì)胞亦可見(jiàn)；至第5d時(shí)，細(xì)胞Nestin表達(dá)較第1d明顯下降，而NF-M表達(dá)增強(qiáng)。 4.間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)HIBD大鼠影響通過(guò)結(jié)扎頸總動(dòng)脈缺氧經(jīng)典方法造HIBD大鼠模型，治療組予腦室注射hUCB-MSCs，對(duì)照組及HIBD組予腦室注射等量生理鹽水，免疫組

11、織化學(xué)結(jié)果顯示，在受損半球，HIBD組與治療組各個(gè)時(shí)間點(diǎn)VEGF表達(dá)強(qiáng)度及微小血管密度顯著高于對(duì)照組。在移植后第1d，HIBD組及治療組VEGF表達(dá)強(qiáng)度無(wú)差異。第3、7d治療組VEGF表達(dá)強(qiáng)度及新生小血管均多于HIBD組，至2周兩組再次恢復(fù)到相同水平。通過(guò)免疫組化檢測(cè)，在治療組大鼠腦組織切片中可以看到Brdu陽(yáng)性細(xì)胞。 結(jié)論:1.利用密度梯度離心結(jié)合細(xì)胞貼壁的方法，從臍血中成功分離到臍血中的MSCs并穩(wěn)定傳代。采用20％FBS/

12、DMEM培養(yǎng)體系可以對(duì)其中MSCs進(jìn)行培養(yǎng)、傳代并擴(kuò)增，原代細(xì)胞生長(zhǎng)速度較慢，需45天左右才能生長(zhǎng)至80％～90％融合?？赡芘c原代細(xì)胞中MSCs量少，之間的相互促生長(zhǎng)左右有限導(dǎo)致，傳至3代，MSCs生長(zhǎng)速度明顯加快，2周左右即可達(dá)80％～90％融合。探索出一種比較簡(jiǎn)便成熟的MSCs擴(kuò)增培養(yǎng)方法。 2.運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)對(duì)通過(guò)密度梯度離心結(jié)合貼壁法從臍血中分離的細(xì)胞表面抗原進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示此群細(xì)胞表面MSCs相關(guān)抗原CD29

13、、CD44及CD90抗原呈高表達(dá)狀態(tài)，CD34及CD45陽(yáng)性細(xì)胞含量極少。CD34及CD45為造血干細(xì)胞表面標(biāo)志，可見(jiàn)密度離心所得臍血單個(gè)核細(xì)胞經(jīng)過(guò)貼壁法傳代培養(yǎng)純化后，分離出間充質(zhì)干細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)。 3.本研究中，采用20％FBS/DMEM培養(yǎng)體系及化學(xué)藥物類(lèi)誘導(dǎo)劑BME、BHA及DMSO成功地對(duì)臍血間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)，利用細(xì)胞免疫組化技術(shù)對(duì)誘導(dǎo)后細(xì)胞進(jìn)行定性檢測(cè)，觀察到細(xì)胞胞漿在誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)向神經(jīng)細(xì)

14、胞形態(tài)轉(zhuǎn)變，誘導(dǎo)后細(xì)胞Nestin和NF-M呈陽(yáng)性。成功證實(shí)了臍血來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞，通過(guò)誘導(dǎo)MSCs成功轉(zhuǎn)化成神經(jīng)元樣細(xì)胞，至于是否具有神經(jīng)細(xì)胞功能尚需進(jìn)一步通過(guò)電生理及細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)等手段研究證實(shí)。 4.MSCs移植治療腦損傷是目前的一個(gè)研究熱點(diǎn)，近年來(lái)的研究MSCs的移植主要是通過(guò)腦室內(nèi)注射及靜脈注射，本研通過(guò)立體定位儀腦室內(nèi)注射將Brdu標(biāo)記hUCB-MSCs移植給HIBD大鼠，在移植后第3、7及14d時(shí)間點(diǎn)，在大鼠腦組織切

15、片中，發(fā)現(xiàn)Brdu標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞。證實(shí)通過(guò)腦室內(nèi)注射的h-MSCs進(jìn)入腦組織并成活定植。 5.本實(shí)驗(yàn)采用結(jié)扎頸總動(dòng)脈同時(shí)給予低氧環(huán)境法成功復(fù)制了新生大鼠缺氧缺血腦損傷模型。模型大鼠損傷側(cè)腦組織切片看到了明顯神經(jīng)細(xì)胞排列混亂、空泡性變，皮質(zhì)、海馬、丘腦等區(qū)域出現(xiàn)大片的細(xì)胞壞死、溶解等現(xiàn)象。發(fā)現(xiàn)造模過(guò)程中，麻醉組大鼠死亡率高于非麻醉組，可能與麻醉后呼吸功能抑制，缺氧過(guò)程中不能充分通過(guò)肺代償酸中毒有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)觀察到HIBD大鼠腦組織VE