人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療DCM大鼠的實驗研究.pdf

1、目的：
　　 應(yīng)用腹腔注射阿霉素建立擴張型心肌病(dilatedcardiomyopathy，DCM)Wistar大鼠模型[1]，培養(yǎng)擴增人臍血間充質(zhì)干細(xì)胞(humanumbilicalcordbloodmesenchymalstemcells，HUCB-MSCs)，流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)鑒定為間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSC)后，經(jīng)尾靜脈移植HUCB-MSCs到DCM大鼠

2、，觀察心肌內(nèi)HUCB-MSCs的定植情況及其對DCM大鼠心肌病理積分、LVEF和血漿腦鈉肽(Brainnatriureticpeptide，BNP)的影響，免疫熒光及免疫組化染色檢測大鼠心肌組織中HUCB-MSCs的心肌肌鈣蛋白T(CardiacTroponinT，cTnT)的表達(dá)，以探討HUCB-MSCs移植后改善DCM大鼠心功能的作用機制。
　　 方法：
　　 將100只Wistar大鼠隨機分為正常對照組(簡稱正常組

3、，n=10)和實驗組(n=90)。實驗組參照文獻(xiàn)建立DCM模型，并將成功建模的46只實驗組大鼠隨機分為DCM對照組(簡稱對照組，n=23)、DCMHUCB-MSCs治療組(簡稱治療組，n=23)。在無菌條件下取健康產(chǎn)婦分娩胎兒時的臍帶血，利用密度梯度法分離臍血單個核細(xì)胞(mononuclearcells，MNCs)，貼壁法培養(yǎng)進(jìn)行原代培養(yǎng)并傳代到第三代(P3)以獲取HUCB-MSCs。取P3代細(xì)胞分別通過流式細(xì)胞儀(flowcytome

4、try，F(xiàn)CM)檢測細(xì)胞表面抗原CD29、CD34、CD45、CD105以鑒定為HUCB-MSCs，應(yīng)用臺盼藍(lán)染色計數(shù)HUCB-MSCs數(shù)量并計算活細(xì)胞率；然后應(yīng)用5-溴脫氧尿嘧啶(5-Bromo-2-deoxyUridine，Brdu)標(biāo)記HUCB-MSCs后，檢測Brdu標(biāo)記率，先后兩次(間隔2周)經(jīng)尾靜脈注射到治療組大鼠體內(nèi)。4周后對各組大鼠進(jìn)行病理檢查計算病理積分；超聲心動圖評價LVEF，ELISA法檢測大鼠血漿BNP；應(yīng)用免疫

5、組化和激光共聚焦細(xì)胞儀(laserscanningconfocalmicroscope，LSCM)檢測Brdu標(biāo)記的HUCB-MSCs表達(dá)cTnT的情況。
　　 結(jié)果：
　　 1.所獲取的HUCB-MSCs的鑒定及標(biāo)記結(jié)果：應(yīng)用貼壁法培養(yǎng)獲取的HUCB-MSCs經(jīng)臺盼蘭實驗測定活細(xì)胞率>95％；應(yīng)用FCM檢測顯示其穩(wěn)定地高表達(dá)CD29、CD105(分別為93.37％、89.08％)；而微弱表達(dá)CD34、CD45(分別為0

6、.89％、1.06％)。HUCB-MSCs應(yīng)用終濃度10μmol/L的Brdu標(biāo)記72h后的標(biāo)記率為87％。
　　 2.治療后正常組、對照組和治療組大鼠心肌病理積分、LVEF和血漿BNP的變化：①治療組治療4周后心肌病理積分(0.82±0.37)與治療前(1.17±0.81)以及對照組(1.62±0.64)相比均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但仍高于正常組(0.12±0.04)，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)

7、；②治療組治療后LVEF(62.36±4.72)與治療前(40.02±2.04)以及對照組(32.52±4.42)相比較，均明顯好轉(zhuǎn)，其間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；但仍然低于正常組(78.14±3.64)，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；③治療組治療4周后BNP為(364.22±30.27)，與治療前(513.35±27.33)以及對照組(592.58±35.74)相比均明顯減低，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，但仍高于

8、正常組(76.03±5.27)，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　 3.免疫組化染色及激光共聚焦細(xì)胞儀檢測治療組HUCB-MSCs在心肌中的定植及分化的結(jié)果：①免疫組化染色可見治療組大鼠心肌中Brdu標(biāo)記的HUCB-MSCs散在分布，細(xì)胞核為棕黃色，胞質(zhì)中可見棕黃色肌原纖維結(jié)構(gòu)；②激光共聚焦細(xì)胞儀觀察治療組心肌組織HUCB-MSCs表達(dá)cTnT的情況，可見Brdu標(biāo)記的HUCB-MSCs散在分布呈(紅色)，其表達(dá)的cTn

9、T呈(綠色)，細(xì)胞核為藍(lán)色。
　　 結(jié)論：
　　 1、人臍血經(jīng)密度梯度離心后應(yīng)用貼壁法培養(yǎng)可獲得足量可靠的HUCB-MSCs，其表達(dá)的表面抗原符合MSCs的特征。
　　 2、應(yīng)用HUCB-MSCs移植治療DCM大鼠可明顯改善心肌病理損傷，提高LVEF，降低血漿BNP，有明顯改善DCM大鼠心功能的作用。
　　 3、經(jīng)尾靜脈移植的HUCB-MSCs散在分布于DCM大鼠心肌中，并表達(dá)心肌細(xì)胞特異性蛋白cTnT，