轉(zhuǎn)染HOXB4基因的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增人臍血CD34+細(xì)胞的研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:建立穩(wěn)定表達(dá)人同源盒基因(Homeobox Gene) HOXB4的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞滋養(yǎng)層,探討直接轉(zhuǎn)染HOXB4基因與以轉(zhuǎn)染HOXB4基因的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞為滋養(yǎng)層對人臍血CD34+細(xì)胞體外擴(kuò)增的不同,包括對有核細(xì)胞數(shù)、CD34+細(xì)胞比例與擴(kuò)增倍數(shù)、細(xì)胞周期及集落形成能力等干細(xì)胞特征的比較。
   方法:將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HUCMSC)分為兩組,一組利用慢病毒載體將HOXB4基因轉(zhuǎn)染至HUCMSC(HOXB4-H

2、UCMSC),一組為未轉(zhuǎn)染的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(HUCMSC),兩組細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素C(MMC)處理后作為飼養(yǎng)層細(xì)胞備用。應(yīng)用免疫磁珠分選系統(tǒng)(magnetic activated cell sorting,MACS)分選人臍血CD34+細(xì)胞,在含細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h后分5組,其中包括對照組2組:A組CD34+細(xì)胞為空白對照組;B組以轉(zhuǎn)染空病毒的CD34+細(xì)胞為陰性對照組;實(shí)驗(yàn)組共3組:直接轉(zhuǎn)染HOXB4基因的CD34+細(xì)胞為C組

3、;以HUCMSC為滋養(yǎng)層的CD34+細(xì)胞為D組;以HOXB4-HUCMSC為滋養(yǎng)層的CD34+細(xì)胞為E組。培養(yǎng)第6、10、14天計數(shù)并比較各組的有核細(xì)胞數(shù)(NC),并于第10天比較不同處理?xiàng)l件對CD34+細(xì)胞比例、細(xì)胞周期與集落形成能力的影響。
   結(jié)果:利用慢病毒載體可將HOXB4基因轉(zhuǎn)染至HUCMSC并檢測到HOXB4在mRNA水平上的表達(dá),應(yīng)用濃度為10μ g/ml的絲裂霉素C建立HUCMSC與HOXB4-HUCMSC滋

4、養(yǎng)層,并檢測到目的基因在mRNA水平上的表達(dá)。應(yīng)用免疫磁珠分選技術(shù)成功分選出人臍血CD34+細(xì)胞,純度達(dá)87%。經(jīng)過14天體外培養(yǎng),5組的有核細(xì)胞(NC)均得到顯著擴(kuò)增,空白對照組、陰性對照組、直接轉(zhuǎn)染HOXB4基因組、HUCMSC滋養(yǎng)層組、HOXB4-HUCMSC滋養(yǎng)層組兩對照組擴(kuò)增倍數(shù)依次為:(109.07±14.38)、(119.23±14.61)、(359.90±25.05)、(250.20±22.68)、(401.90±21.

5、51),經(jīng)比較:HOXB4-HUCMSC滋養(yǎng)層組>直接轉(zhuǎn)染HOXB4基因組>HUCMSC滋養(yǎng)層組>兩對照組,p<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。體外擴(kuò)增第10天檢測5組有核細(xì)胞中CD34+細(xì)胞比例均大幅下降,經(jīng)計算實(shí)驗(yàn)組CD34+細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)較第0天顯著擴(kuò)增,比較CD34+細(xì)胞比例與擴(kuò)增倍數(shù)均為直接轉(zhuǎn)染HOXB4基因組>HOXB4-HUCMSC滋養(yǎng)層組>HUCMSC滋養(yǎng)層組>兩對照組,p<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。應(yīng)用流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周

6、期,實(shí)驗(yàn)組較對照組的S+G2/M比例高,其中HOXB4-HUCMSC滋養(yǎng)層組比例最高為41.57%,高于直接轉(zhuǎn)染HOXB4基因的37.87%與HUCMSC的滋養(yǎng)層組的28.65%,p<0.05,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。HOXB4-HUCMSC滋養(yǎng)層組與直接轉(zhuǎn)HOXB4基因組的集落形成能力無差別,但二者均高于HUCMSC滋養(yǎng)層組與對照組。
   結(jié)論:(1)本實(shí)驗(yàn)成功建立轉(zhuǎn)染與未轉(zhuǎn)染HOXB4基因的人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞滋養(yǎng)層;(2)采用免

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