人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外擴(kuò)增及其免疫調(diào)節(jié)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)對(duì)PHA或異體抗原作用下的T淋巴細(xì)胞分泌功能的免疫調(diào)節(jié)作用，初步探討MSCs誘導(dǎo)免疫耐受，降低移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)發(fā)生率的機(jī)制。 研究方法：通過(guò)Fico11分離法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，體外培養(yǎng)擴(kuò)增出MsCs，并通過(guò)形態(tài)學(xué)特征及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面標(biāo)志加以鑒定。通過(guò)Ficoll分離法和尼龍棉柱

2、法獲取外周血T淋巴細(xì)胞，將不同數(shù)量的MSCs與PHA活的T細(xì)胞共培養(yǎng)4天，收集培養(yǎng)上清液；將不同數(shù)量的MSCs加入混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(mixed lymphocyte reaction，MLR)體系共培養(yǎng)7天，收集培養(yǎng)上清液；將不同濃度的MSCS培養(yǎng)上清加入MLR體系共培養(yǎng)7天，收集培養(yǎng)上清液。應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)分別檢測(cè)各培養(yǎng)上清液中T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子水

3、平，包括IL-2和INF-Y(主要由Thl細(xì)胞分泌)，IL-4和IL-10(主要由Th2細(xì)胞分泌)。 結(jié)果：骨髓單個(gè)核細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶后，2～4天可見(jiàn)成纖維樣貼壁細(xì)胞逐漸出現(xiàn)，增殖速度較慢；7～11天散在的成纖維樣貼壁細(xì)胞增殖較快，細(xì)胞形態(tài)均一；2周左右，細(xì)胞生長(zhǎng)呈漩渦狀或平行狀排列，細(xì)胞融合可到達(dá)90％。傳代細(xì)胞生長(zhǎng)迅速，主要呈成纖維樣，約第7～10天可達(dá)到融合。流式細(xì)胞儀檢測(cè)人骨髓MSCs表面抗原高表達(dá)CD29、CD105、

4、CD166：而低表達(dá)CD34、CD45、HLA-DR。與未加骨髓MSCs的對(duì)照組A相比，不同細(xì)胞數(shù)量的MSCs和PHA作用下的T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)4天后，骨髓MSCs抑制T細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-4、IL-2(P<0.05)。骨髓MSCs對(duì)IFN-γ和IL-2的影響顯著，對(duì)IL-4的影響較低，且這種抑制作用呈MSCs數(shù)量依賴(lài)性(P<0.05)。骨髓MSCs促進(jìn)了IL-10的分泌(P<0.05)，這種促進(jìn)作用在MSCs>1×10<'4>時(shí)呈

5、MSCs數(shù)量依賴(lài)性(P<0.05)。 與未加骨髓MSCs的對(duì)照組B相比，不同細(xì)胞數(shù)量的MSCs加入MIC體系中共培養(yǎng)7天后，骨髓MSCs抑制T細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-4、IL-2(P<0.05)。骨髓MSCs對(duì)IFN-γ的影響明顯，且這種抑制作用呈數(shù)量依賴(lài)性(P<0.05)；骨髓MSCs對(duì)IL-2、IL-4分泌的抑制作用較低，且與MSCs數(shù)量多少無(wú)關(guān)系。MSCs>5×10<'3>時(shí)，骨髓MSCs促進(jìn)了T細(xì)胞IL-10的分泌

6、(P<0.05)，且這種促進(jìn)作用存在數(shù)量依賴(lài)性(P<0.05)。 與未加骨髓MSCs培養(yǎng)上清的對(duì)照組C相比，不同濃度的骨髓MSCs培養(yǎng)上清液加入MLC體系中共培養(yǎng)7天后，培養(yǎng)上清可以抑制T細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-4、IL-2(P<0.05)。上清液對(duì)IFN-γ的影響明顯，且這種抑制作用呈MSCs培養(yǎng)上清濃度依賴(lài)性(P<0.05)；在MSCs培養(yǎng)上清濃度≤50％時(shí)，MSCs對(duì)IL-2分泌抑制作用亦呈濃度依賴(lài)性(P<0.05)，

7、但作用輕微；MSCs對(duì)IL-4抑制作用與加入上清量多少無(wú)關(guān)。骨髓MSCs培養(yǎng)上清液不影響IL-10的分泌(P>0.05)。 結(jié)論： 1．采用密度梯度分離法和貼壁篩選法相結(jié)合能夠成功體外擴(kuò)增培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞，且其具有均一的表面標(biāo)志； 2．在PHA或異體抗原存在的情況下，MSCs均可抑制Th1細(xì)胞分泌IL-2和IFN-γ，但對(duì)Th2細(xì)胞分泌IL-4和IL-10的作用相反，其對(duì)Th2細(xì)胞亞群的作用有待進(jìn)一步證明。此外