小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞樣表型和多向分化潛能以及抑制樹突狀細(xì)胞成熟的功能.pdf

1、角膜基質(zhì)細(xì)胞(corneal stroma cells，CSCs)是散在分布于角膜基質(zhì)內(nèi)神經(jīng)嵴來(lái)源的細(xì)胞，對(duì)維持角膜透明性發(fā)揮著重要作用。在體CSCs數(shù)量稀少，所以在體外對(duì)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)擴(kuò)增是必經(jīng)的研究路徑。研究表明，培養(yǎng)于含胎牛血清(FBS)的完全培養(yǎng)基內(nèi)的CSCs會(huì)喪失其原有的生物學(xué)特性。然而，當(dāng)培養(yǎng)于無(wú)血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基時(shí)，細(xì)胞雖能保持其特性不變，卻無(wú)法進(jìn)行有效增殖。因此，如何在保持細(xì)胞生物學(xué)特性不變的情況下高效擴(kuò)增CSCs，是目前研

2、究難點(diǎn)之一。
　　 研究表明，出生后增殖性CSCs的細(xì)胞數(shù)量會(huì)迅速減少。當(dāng)瞼裂打開后，所有CSCs的細(xì)胞周期進(jìn)入G0期。最近研究證實(shí)，CSCs表達(dá)眾多干細(xì)胞標(biāo)記物，并且具有多向分化潛能，與間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性十分相似。然而，目前尚缺乏小鼠CSCs是否具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性的研究。
　　 樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)是目前已知體內(nèi)功能最強(qiáng)的抗原呈遞細(xì)胞。成熟DCs可引發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，而未成熟DCs

3、則會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體免疫耐受。而且，角膜內(nèi)的DCs廣泛的參與了多種角膜相關(guān)疾病以及角膜移植免疫排斥反應(yīng)，且以角膜內(nèi)DCs為靶細(xì)胞的治療方法已取得可喜的療效。因此，對(duì)角膜內(nèi)的DCs，尤其對(duì)DCs成熟狀態(tài)的研究具有重要意義。
　　 最近研究表明，位于角膜中央?yún)^(qū)的DCs完全處于未成熟狀態(tài)，而位于角膜周邊區(qū)的DCs則大多處于成熟狀態(tài)。局部微環(huán)境對(duì)DCs的成熟狀態(tài)發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)功能。所以，我們推測(cè)CSCs可能具有影響角膜內(nèi)DCs成熟狀態(tài)的功能，

4、然而至今尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。
　　 因此，本研究旨在探索如何在體外有效擴(kuò)增小鼠CSCs以及對(duì)CSCs的間充質(zhì)干細(xì)胞特性和抑制DCs成熟的功能進(jìn)行探討。如下：
　　 第一部分小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞的提取、鑒定以及培養(yǎng)擴(kuò)增
　　 目的：研究使用KSFM培養(yǎng)基能否獲取具有增殖能力且保持生物學(xué)特性不變的小鼠CSCs。
　　 方法：將中央?yún)^(qū)角膜置于EDTA液(20mmol/L)內(nèi)孵育45min后，用手術(shù)顯微鑷小心剝離角膜上皮

5、層以及內(nèi)皮層，并將獲取的角膜基質(zhì)置于含300U/mLⅠ型膠原酶的溶液中消化4h。離心后采用DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、DMEM完全培養(yǎng)基（含10％FBS）以及KSFM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)常規(guī)培養(yǎng)，并采用含1U/mL分散酶的EDTA液消化傳代細(xì)胞。同時(shí)，觀察細(xì)胞并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線；采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測(cè)細(xì)胞角膜蛋白多糖(keratocan)、乙醛脫氫酶(ALDH)、細(xì)胞角蛋白12(CK12)和神經(jīng)元特異性烯醇化酶(

6、NSE)等基因的表達(dá)情況；采用細(xì)胞免疫熒光染色以及蛋白質(zhì)印跡方法檢測(cè)細(xì)胞keratocan蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：通過(guò)膠原酶消化的方法可以從每只小鼠的角膜基質(zhì)獲取約1×104單個(gè)細(xì)胞。RT-PCR結(jié)果顯示：原代細(xì)胞表達(dá)CSCs標(biāo)記物keratocan和ALDH，不表達(dá)角膜上皮細(xì)胞標(biāo)記物CK12以及角膜內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物NSE;免疫熒光染色和蛋白質(zhì)印跡結(jié)果顯示：原代細(xì)胞表達(dá)keratocan蛋白。因此，本實(shí)驗(yàn)獲取的原代細(xì)胞為CS

7、Cs。培養(yǎng)于DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)的原代CSCs無(wú)法增殖。培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基內(nèi)的CSCs可增殖，但第3代細(xì)胞不表達(dá)keratocan和ALDH基因以及keratocan蛋白。培養(yǎng)于KSFM培養(yǎng)基內(nèi)的CSCs也可增殖，第3代細(xì)胞仍表達(dá)keratocan和ALDH基因以及keratocan蛋白，且與原代細(xì)胞相比，表達(dá)強(qiáng)度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：KSFM培養(yǎng)基不僅能維持小鼠CSCs的生物學(xué)特性不變，還能有效促進(jìn)

8、細(xì)胞增殖。
　　 第二部分小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞樣表型以及多向分化潛能
　　 目的：研究KSFM培養(yǎng)基培養(yǎng)擴(kuò)增后的小鼠CSCs是否具有間充質(zhì)干細(xì)胞樣表型以及多向分化潛能。
　　 方法：在去除角膜上皮層以及內(nèi)皮層后，通過(guò)膠原酶消化的方法獲取小鼠中央?yún)^(qū)角膜來(lái)源的CSCs，并采用KSFM培養(yǎng)基對(duì)其培養(yǎng)擴(kuò)增。收集第2代CSCs，將細(xì)胞與造血干細(xì)胞標(biāo)記物抗體（CD34-FITC、CD45-PE）以及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物抗

9、體(CD105-PE、CD90-FITC、CD71-FITC、CD29-APC)共孵育30min后，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。當(dāng)培養(yǎng)于KSFM培養(yǎng)基內(nèi)的CSCs達(dá)細(xì)胞融合后，更換成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10％ FBS、100nmol/L地塞米松、10mmol/Lβ-磷酸甘油、50mg/L維生素C的DMEM培養(yǎng)基）、脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基（含10％FBS、0.5μmol/L地塞米松、0.5mmol/L3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、10mg/L胰島

10、素的DMEM培養(yǎng)基）以及對(duì)照培養(yǎng)基（含10％FBS的DMEM培養(yǎng)基），進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，每3d更換一次培養(yǎng)基。21d后，對(duì)培養(yǎng)于成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基以及對(duì)照培養(yǎng)基內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行2％茜素紅S染色，并通過(guò)RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞堿性磷酸酶和骨鈣素等基因的表達(dá)情況；對(duì)培養(yǎng)于脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基以及對(duì)照培養(yǎng)基內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行0.3％油紅O染色，并通過(guò)RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞脂蛋白脂酶和過(guò)氧化物酶增殖物激活受體γ等基因的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)

11、對(duì)第2代CSCs的表型特征進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：細(xì)胞低表達(dá)CD34（3.68％±1.44％）以及CD45（9.56％±1.83％），高表達(dá)CD29（96.85％±1.91％）、CD90（93.62％±1.65％）、CD105(50.91％±2.56％)以及CD71（45.27％±3.56％）。在成骨誘導(dǎo)條件下，3d時(shí)，細(xì)胞形態(tài)仍然保持梭形，與對(duì)照組細(xì)胞無(wú)明顯差別。7d時(shí)，細(xì)胞形態(tài)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘟切?，胞漿內(nèi)出現(xiàn)黑色顆粒。14d時(shí)，開始形成礦化

12、結(jié)節(jié)，并逐漸增大，21d時(shí)，經(jīng)茜素紅S染色，結(jié)節(jié)呈現(xiàn)鮮紅色。對(duì)照組細(xì)胞未顯現(xiàn)出以上成骨細(xì)胞分化的形態(tài)學(xué)征象，且經(jīng)茜素紅S染色未見(jiàn)陽(yáng)性結(jié)果。通過(guò)RT-PCR檢測(cè)成骨細(xì)胞標(biāo)記物基因的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：成骨誘導(dǎo)條件下細(xì)胞高表達(dá)堿性磷酸酶和骨鈣素，而對(duì)照組細(xì)胞低表達(dá)堿性磷酸酶且不表達(dá)骨鈣素。在脂肪誘導(dǎo)條件下，7d時(shí)，細(xì)胞形態(tài)逐漸由梭形轉(zhuǎn)變?yōu)轭悎A形，胞漿內(nèi)液滴也逐漸增多。14d時(shí)，細(xì)胞胞漿內(nèi)滿布液滴，經(jīng)油紅O染色，液滴被特異性染成橘紅色。RT-

13、PCR結(jié)果顯示：脂肪誘導(dǎo)條件下細(xì)胞表達(dá)脂蛋白脂酶和過(guò)氧化物酶增殖物激活受體γ。而對(duì)照組細(xì)胞未顯現(xiàn)出向脂肪細(xì)胞分化的任何征象。
　　 結(jié)論：經(jīng)KSFM培養(yǎng)基培養(yǎng)擴(kuò)增的小鼠中央?yún)^(qū)角膜來(lái)源的CSCs具有與間充質(zhì)干細(xì)胞相似的表型特征，以及向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的能力。
　　 第三部分小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)上清液對(duì)樹突狀細(xì)胞成熟的抑制作用
　　 目的：研究小鼠CSCs培養(yǎng)上清液是否具有抑制脂多糖誘導(dǎo)的DCs成熟的作用。

14、r>　　 方法：通過(guò)尼龍毛柱法獲取BALB/c小鼠脾臟來(lái)源的T細(xì)胞，并通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物CD3以測(cè)定T細(xì)胞純度。原代小鼠CSCs(105/mL)培養(yǎng)于RPMI1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基內(nèi)，3d后半量換液，6d后收集培養(yǎng)上清液以備用。在裂解紅細(xì)胞后，將由C57BL/6小鼠股骨獲取的骨髓單核細(xì)胞培養(yǎng)于含10％FBS以及10ng/mL重組小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子的RPMI1640培養(yǎng)基內(nèi)，2d后全量換液，4d后半量換液，6d

15、后收集懸浮和半貼壁細(xì)胞，即為未成熟DCs。通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物CD11c以測(cè)定DCs純度。向DCs培養(yǎng)液內(nèi)加入脂多糖（1μg/mL），48h后未成熟DCs可被誘導(dǎo)成熟。為研究CSCs培養(yǎng)上清液對(duì)DCs成熟的作用，在DCs成熟過(guò)程中，不同濃度的培養(yǎng)上清液(25％、50％)被添加至DCs培養(yǎng)液中。而后，通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)DCs成熟狀態(tài)標(biāo)記物CD80、CD86和主要組織相容性抗原Ⅱ類分子(MHC-Ⅱ)，以對(duì)DCs的表型成熟狀態(tài)

16、進(jìn)行鑒定；通過(guò)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)DCs刺激T細(xì)胞增殖能力以及通過(guò)FITC標(biāo)記葡聚糖內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗原吞噬功能，以對(duì)DCs的功能成熟狀態(tài)進(jìn)行鑒定。
　　 結(jié)果：小鼠脾臟細(xì)胞經(jīng)紅細(xì)胞裂解以及尼龍毛柱篩選提取后，可得到大量單個(gè)懸浮的小細(xì)胞。經(jīng)流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)，細(xì)胞高表達(dá)T細(xì)胞標(biāo)記物CD3(93.97％±3.06％)。小鼠骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)6d后，細(xì)胞集落明顯，呈懸浮或半貼壁生長(zhǎng)。細(xì)胞表面可見(jiàn)長(zhǎng)短不一的毛刺狀突起，且高表達(dá)CD11c(

17、78.61％±4.27％)，低表達(dá)CD80、CD86和MHC-Ⅱ。細(xì)胞經(jīng)脂多糖刺激48h后，CD80、CD86和MHC-Ⅱ的表達(dá)明顯上調(diào)。在DCs成熟過(guò)程中，將不同濃度的CSCs培養(yǎng)上清液(25％、50％)添加至DCs培養(yǎng)液后，與對(duì)照組相比，DCsCD80、CD86和MHC-Ⅱ的表達(dá)均降低（P＜0.01），CD11c的表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0.05）；刺激T細(xì)胞增殖能力降低（P＜0.05）；抗原吞噬功能增強(qiáng)(P＜0.01)。此外，CSCs

18、培養(yǎng)上清液抑制DCs成熟的作用還呈現(xiàn)出劑量依賴性（25％vs.50％，P＜0.05）。
　　 結(jié)論：小鼠CSCs培養(yǎng)上清液可以抑制脂多糖誘導(dǎo)的DCs表型以及功能成熟，且呈劑量依賴性。因此，我們推測(cè)CSCs可以通過(guò)分泌可溶性免疫調(diào)節(jié)因子抑制DCs成熟。
　　 第四部分小鼠角膜基質(zhì)細(xì)胞通過(guò)分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2以及前列腺素E2抑制樹突狀細(xì)胞成熟
　　 目的：探索小鼠CSCs是否通過(guò)分泌轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(TGF-β2)、

19、前列腺素E2(PGE2)、白介素10(1L-10)以及巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)抑制DCs成熟。
　　 方法：采用RT-PCR檢測(cè)原代小鼠CSCsTGF-β2、IL-10、M-CSF以及前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2(PTGS2)等基因的表達(dá)情況。據(jù)此，通過(guò)酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)測(cè)定CSCs培養(yǎng)上清液以及新鮮RPMI1640培養(yǎng)基內(nèi)PGE2和TGF-β2的含量。而后，通過(guò)應(yīng)用TGF-β2中和抗體（15μg/mL）以及P

20、GE2受體阻滯劑AH6809（100μmol/L），對(duì)CSCs是否通過(guò)分泌TGF-β2以及PGE2抑制DCs成熟作進(jìn)一步鑒定。在DCs成熟過(guò)程中，分別作以下不同處理：1，LPS;2，LPS+50％CSCs培養(yǎng)上清液；3，LPS+50％CSCs培養(yǎng)上清液+AH6809;4，LPS+50％CSCs培養(yǎng)上清液+中和抗體；5，LPS+50％CSCs培養(yǎng)上清液+AH6809+中和抗體。然后，應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)DCsCD11c、CD80、CD86

21、和MHC-Ⅱ的表達(dá)情況，通過(guò)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)檢測(cè)刺激T細(xì)胞增殖能力，以及通過(guò)FITC標(biāo)記葡聚糖內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗原吞噬功能。
　　 結(jié)果：RT-PCR結(jié)果表明：原代小鼠CSCs高表達(dá)TGF-β2和PTGS2，低表達(dá)M-CSF，不表達(dá)IL-10;ELISA數(shù)據(jù)顯示：與新鮮RPMI1640培養(yǎng)基相比，CSCs培養(yǎng)上清液內(nèi)含有較高濃度的TGF-β2（1.46±0.38ng/mL）和PGE2（21.27±0.94ng/mL）。向CSCs培養(yǎng)

22、上清液中加入TGF-β2中和抗體，可以不同程度的逆轉(zhuǎn)CSCs培養(yǎng)上清液對(duì)DCs表型以及功能成熟的抑制作用（P＜0.05或P＜0.01）。使用AH6809預(yù)處理未成熟DCs同樣可以不同程度的逆轉(zhuǎn)CSCs培養(yǎng)上清液對(duì)DCs功能成熟的抑制作用(P＜0.05)，以及對(duì)CD86和MHC-Ⅱ表達(dá)的抑制作用(P＜0.05或P＜0.01)，但不能逆轉(zhuǎn)對(duì)CD80表達(dá)的抑制作用（P＞0.05）。同時(shí)應(yīng)用TGF-β2中和抗體以及AH6809，可以提高DCsM