肋軟骨膜、肋軟骨和骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞的比較.pdf

1、由于間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)來源的多樣性、體外誘導(dǎo)的多向分化性，沒有特定的表面表記等特點(diǎn)，對(duì)其起源有不同的觀點(diǎn)。學(xué)者們多認(rèn)為MSCs是存在于組織和器官中的成體干細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)擴(kuò)增而成。但Orkin等提出：體內(nèi)也可能不存在MSCs，只是在體外培養(yǎng)分離到的細(xì)胞時(shí)，這些細(xì)胞被激發(fā)轉(zhuǎn)變或者基因重編，成為具有干細(xì)胞特性的細(xì)胞。成熟的細(xì)胞能否轉(zhuǎn)化成干細(xì)胞呢?已有報(bào)道從軟骨中分離到干細(xì)胞，但體內(nèi)僅生長(zhǎng)區(qū)外

2、的軟骨組織中無干細(xì)胞，關(guān)節(jié)軟骨也有干細(xì)胞。從軟骨中分離到的干細(xì)胞是來自軟骨中的干細(xì)胞還是由軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化而成的呢?本實(shí)驗(yàn)擬分別從兔非生長(zhǎng)區(qū)肋軟骨膜、肋軟骨和骨髓中分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增獲得干細(xì)胞，觀察軟骨細(xì)胞能否轉(zhuǎn)化為干細(xì)胞?幾種來源干細(xì)胞的差異?有助于認(rèn)識(shí)成體干細(xì)胞體外分離獲取的機(jī)制，以及干細(xì)胞臨床應(yīng)用研究的基礎(chǔ)理論。
　　第一部分兔肋軟骨膜、肋軟骨和骨髓來源干細(xì)胞的分離培養(yǎng)
　　1材料與方法
　　取3-4周新西蘭大白兔的肋

3、軟骨(避開肋生長(zhǎng)板區(qū))，解剖顯微鏡下剝離軟骨膜，肋軟骨和肋軟骨膜均經(jīng)酶消化法分別獲取肋軟骨和肋軟骨膜細(xì)胞；另取股骨、脛骨的骨髓細(xì)胞。三種來源的細(xì)胞均以貼壁法分離、培養(yǎng)、擴(kuò)增，分別獲得3種來源的干細(xì)胞。觀察3者各代細(xì)胞的形態(tài)和生長(zhǎng)。
　　取三種來源的第3代細(xì)胞，以1×104個(gè)細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每天隨機(jī)各取3個(gè)培養(yǎng)孔，共10天，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線。
　　2結(jié)果
　　從肋軟骨膜中分離的原代細(xì)胞接種12h后開

4、始貼壁，5-6 d細(xì)胞融合，聚集成團(tuán)，以圓形和多邊形為主，從第2代開始細(xì)胞形態(tài)均一，以梭形為主，呈漩渦狀排列。目前己傳至15代。從肋軟骨中分離的原代細(xì)胞6h后開始貼壁，5-6天細(xì)胞融合，以鋪路石形態(tài)為主，第2代和第3代細(xì)胞逐漸轉(zhuǎn)變成梭形；但第5代出現(xiàn)細(xì)胞老化，只傳至第6代。原代骨髓細(xì)胞培養(yǎng)4-5h后開始貼壁，10d左右細(xì)胞融合。融合時(shí)細(xì)胞可見梭形，第2代以后細(xì)胞形態(tài)以梭形為主，呈明顯漩渦狀排列，已傳10代，生長(zhǎng)良好。
　　三種來源

5、細(xì)胞第3代細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線表明：貼壁后生長(zhǎng)潛伏適應(yīng)期為1-3 d；3 d后即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；6 d后進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期。
　　第二部分肋軟骨膜、肋軟骨和骨髓來源干細(xì)胞的比較
　　1材料與方法
　　1.1三種來源的每一代細(xì)胞均以免疫組化染色方法檢測(cè)每一代細(xì)胞CD29、CD90、CD34和Ⅱ型膠原的表達(dá)。
　　1.2取三種來源的第3代干細(xì)胞分別進(jìn)行體外成脂誘導(dǎo)14天、成骨誘導(dǎo)21天；油紅0和硝酸銀染色法檢測(cè)比較三種干細(xì)胞成

6、脂、成骨的分化能力。
　　2結(jié)果
　　2.1免疫細(xì)胞化學(xué)染色發(fā)觀原代及第1代肋軟骨膜和肋軟骨細(xì)胞均不表達(dá)CD29、CD90、CD34，從第2代細(xì)胞開始表達(dá)CD29、CD90，仍不表達(dá)CD34。原代骨髓細(xì)胞可表達(dá)CD29、CD90和CD34，不表達(dá)Ⅱ型膠原；隨后只表達(dá)CD29和CD90。三種來源的第3代細(xì)胞均只強(qiáng)表達(dá)CD29、CD90，其均一性都達(dá)到99％以上。作為軟骨細(xì)胞標(biāo)記物之一的Ⅱ型膠原，僅原代及第1代肋軟骨細(xì)胞表達(dá)，從

7、第2代細(xì)胞不再表達(dá)。
　　2.2三種來源的第3代干細(xì)胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)14天后，肋軟骨膜和骨髓來源的干細(xì)胞形狀多由梭形轉(zhuǎn)變?yōu)閳A形，肋軟骨來源的干細(xì)胞則逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，細(xì)胞內(nèi)均可見油紅O染色的紅色小脂滴。成骨誘導(dǎo)21天后，肋軟骨膜和肋軟骨來源的干細(xì)胞呈復(fù)層生長(zhǎng)，而骨髓來源的干細(xì)胞成單層生長(zhǎng)。經(jīng)過硝酸銀染色后，黑色鈣化小結(jié)節(jié)分散于肋軟骨膜和肋軟骨來源的干細(xì)胞表面；骨髓來源的干細(xì)胞表面的骨結(jié)節(jié)則聚集成團(tuán)。
　　全文結(jié)論
　　1.

8、用酶消化法，成功的分離、培養(yǎng)和擴(kuò)增了兔肋軟骨膜和肋軟骨來源的干細(xì)胞。用貼壁法提取了骨髓細(xì)胞。體外多次傳代后，肋軟骨膜和骨髓來源的干細(xì)胞比肋軟骨來源的干細(xì)胞具有更強(qiáng)的生長(zhǎng)增殖能力。
　　2.免疫組化檢測(cè)顯示肋軟骨膜和肋軟骨細(xì)胞從第2代開始均表達(dá)MSCs的表型，至第三代強(qiáng)表達(dá)。表明這兩種細(xì)胞第3代具有MSCs的表型特征。
　　3.肋軟骨膜和肋軟骨來源的第3代干細(xì)胞在體外經(jīng)誘導(dǎo)后具有與BMSCs一致的成脂和成骨能力，證明這兩種來源