大鼠局灶性腦缺血再灌注后腦損傷和促紅細(xì)胞生成素的腦保護(hù)作用.pdf

1、缺血性腦血管病是常見病、多發(fā)病，死亡率和致殘率均高，尚缺乏理想治療方法，嚴(yán)重威脅著人類的生命健康，特別是中老年人。 腦缺血所致的損傷可分為原發(fā)性和次發(fā)性兩類(或兩個(gè)階段)。在腦組織血流中斷期間，細(xì)胞能量(主要是氧和葡萄糖)供給中斷，并由此引發(fā)的一系列生化改變?cè)斐蓪?duì)腦組織的損害稱為原發(fā)性損傷。在循環(huán)恢復(fù)后，腦組織雖然又重新獲得了血流灌注和氧供應(yīng)，但各種功能和生化代謝過程并不能同步恢復(fù)到正常狀態(tài)，已經(jīng)啟動(dòng)的原發(fā)性損傷可能繼續(xù)發(fā)展或加

2、重，這種損害稱為次發(fā)性損傷或腦缺血再灌注損傷(cerebralreperfusioninjury，CRI)，CRI的具體機(jī)制尚不完全清楚，但眾多的相關(guān)研究表明，許多參與缺血性腦損傷的因素同樣參與到CRI的病理過程，其中氧自由基的大量釋放，炎癥反應(yīng)，興奮性氨基酸-谷氨酸的興奮毒性作用，鈣超載及血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂等起重要作用。許多學(xué)者利用在體腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ瓦M(jìn)行了大量研究，從形態(tài)學(xué)，生化和基因等多角度證明了細(xì)胞凋亡存在于腦缺血再灌注損傷中，

3、提示細(xì)胞凋亡是腦缺血過程中神經(jīng)元死亡中的另一種形式，特別是在缺血半暗帶和一過性腦缺血后起重要作用。如不能防止神經(jīng)元凋亡的發(fā)生，則“半暗帶”區(qū)將不可避免的成為永久性梗死灶的一部分。 細(xì)胞凋亡(apoptosis)即程序化細(xì)胞死亡(programmedcelldeath，PCD)是細(xì)胞接受某種信號(hào)后或受到某種因素刺激后的一種主動(dòng)的、由一些相關(guān)基因相互作用、通過細(xì)胞內(nèi)的生理、生化反應(yīng)或某些酶的活化以細(xì)胞DNA早期降解為特征的自殺過程。

4、凋亡相關(guān)基因和蛋白的研究也日趨深入。Bcl-2家族成員在神經(jīng)元的死亡過程中起主要作用。其成員分兩類，包括抑制凋亡的Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1和促進(jìn)凋亡的Bax、Bix、Bak、Bad等。Bcl-2家族成員自身和相互之間形成二聚體，二者的比例決定了是否發(fā)生凋亡。Bcl-2蛋白是重要的抑制神經(jīng)元凋亡的蛋白，其過度表達(dá)使許多系統(tǒng)的生存增加，能保護(hù)外源性損害或基因損害。Caspase家族作為特異性的死亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，被認(rèn)為是凋亡的執(zhí)行

5、者。其中Caspase-3是Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中最關(guān)鍵的效應(yīng)蛋白酶，被稱為“殺手蛋白”。 促紅細(xì)胞生成素(erythropoietin,EPO)一直被認(rèn)為是由腎臟分泌的用于調(diào)節(jié)紅細(xì)胞生成的糖蛋白。但近年來的研究表明：EPO不僅在腎臟分泌，而且在肝臟、大腦、子宮等多個(gè)器官被發(fā)現(xiàn)。最近更多的證據(jù)表明在中樞神經(jīng)系統(tǒng)EPO不僅是一個(gè)新的神經(jīng)遞質(zhì)，而且是一個(gè)新的有前景的神經(jīng)保護(hù)劑。重組人促紅細(xì)胞生成素(recombinanthuman

6、erythropoietin,rHuEPO)是一種通過使用重組DNA技術(shù)生產(chǎn)的、含有與天然分離的EPO完全相同氨基酸序列的糖蛋白，且與天然EPO具有相同的生物學(xué)活性。越來越多的研究資料表明EPO具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)活性，在缺血/缺氧時(shí)對(duì)CNS有保護(hù)作用以及EPO和EPO-R在多種細(xì)胞因子聯(lián)合作用下，對(duì)CNS發(fā)育具有調(diào)節(jié)功能。目前，對(duì)EPO所介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)信息傳遞已有所認(rèn)識(shí)，很可能為CNS缺氧/缺血性疾病的治療開辟新途徑。有關(guān)研究提示，EPO對(duì)于C

7、NS的保護(hù)作用，除了可以通過抑制神經(jīng)毒性物質(zhì)谷氨酸釋放，增加細(xì)胞鈣內(nèi)流，抑制NO的過度合成及阻止凋亡等多種機(jī)制外，還存在其他途徑，如對(duì)血管的收縮作用，可以減少局部缺血后由于血管擴(kuò)張產(chǎn)生盜血現(xiàn)象。也有研究表明EPO對(duì)于腦缺血性損傷的保護(hù)效果，也可能是通過減少了氧自由基的生成，從而減輕損傷引起的過氧化反應(yīng)。 本研究擬采用大鼠線栓法制造局灶性腦缺血/再灌注損傷模型來評(píng)價(jià)EPO的腦保護(hù)效果。該模型具有操作簡(jiǎn)便，手術(shù)對(duì)動(dòng)物的創(chuàng)傷較小，沒有

8、顱內(nèi)操作造成腦損傷而混淆實(shí)驗(yàn)結(jié)果的缺點(diǎn)，術(shù)后易恢復(fù)，便于觀察動(dòng)物的神經(jīng)功能缺損癥狀，對(duì)動(dòng)物生理狀態(tài)和應(yīng)激的影響也較小，可以進(jìn)行再灌注研究等優(yōu)點(diǎn)。在給藥劑量和給藥時(shí)間上參考Brines等的研究結(jié)果和EPO的藥代動(dòng)力學(xué)，我們選擇了EPO3000u/kg的藥物劑量，在缺血后0.5h給大鼠腹腔注射，觀察EPO對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注6h，24h后神經(jīng)功能缺損癥狀、腦梗塞體積和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，從行為學(xué)，形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)等方面探討EPO腦

9、保護(hù)作用的機(jī)制，為以后進(jìn)一步研究EPO在神經(jīng)內(nèi)科作為一種有效的神經(jīng)保護(hù)藥進(jìn)入臨床試用做好前期準(zhǔn)備工作。 一、促紅細(xì)胞生成素對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后梗死體積的影響 目的：探討促紅細(xì)胞生成素對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后梗死體積的影響，旨在研究其對(duì)缺血性腦損傷是否有保護(hù)作用。 方法：月齡4～5個(gè)月的Wistar雄性大鼠35只，體重280～320g。隨機(jī)將大鼠分為4組：對(duì)照組、假手術(shù)組、缺血組、EPO組。除對(duì)照組外，各處

10、理組隨機(jī)分為缺血6小時(shí)和24小時(shí)兩小組。每小組動(dòng)物為5只。用10％水合氯醛0.4ml/100g腹腔內(nèi)麻醉，參照Longa等的線栓法統(tǒng)一栓塞大鼠右側(cè)大腦中動(dòng)脈，制備大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(MCAO/R)模型。缺血后0.5h將線栓拔出，讓缺血區(qū)得到再灌注，即為再灌注開始.EPO組于再灌注開始前經(jīng)腹腔注射EPO3000u/kg,缺血組和假手術(shù)組經(jīng)腹腔注射等量的生理鹽水。假手術(shù)組頸內(nèi)動(dòng)脈線栓插入深度＜10mm,余操作步驟同前。對(duì)照組不予手術(shù)，給予

11、生理鹽水1.5ml腹腔內(nèi)注射。用ZeaLonga評(píng)分法，評(píng)分為0分和4分者均被剔除，隨機(jī)補(bǔ)充，保證每組5只不變。將大鼠分別于缺血后6h和24h斷頭取腦，做2mm厚的冠狀切片，將切片立即置于2％紅四氯氮唑(TTC)磷酸緩沖液中避光、37℃恒溫孵育30min。數(shù)碼相機(jī)(索尼公司)拍照后，應(yīng)用病理圖象分析儀(北京航空航天大學(xué)圖象中心制造)測(cè)量腦梗死面積。根據(jù)公式V=t(A1+…An)-(A1+An)t/2算出梗死體積。其中t為切片厚度，A為梗

12、死面積。應(yīng)用SPSS12.0版軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間比較進(jìn)行F檢驗(yàn)(P＜0.05)。 結(jié)論：應(yīng)用EPO作為神經(jīng)保護(hù)劑能明顯縮小大鼠局灶性腦缺血再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)(6h、24h)的梗死體積，與缺血組相比有顯著性差異(P＜0.05)，證實(shí)了EPO作為神經(jīng)保護(hù)劑對(duì)腦缺血再灌注后腦損傷有明顯的保護(hù)作用。 二、促紅細(xì)胞生成素對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡及抗凋亡蛋白Bcl-2、Caspase-3表達(dá)影響 目的：通過

13、觀察EPO作為神經(jīng)保護(hù)劑對(duì)大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)元凋亡及抗凋亡蛋白Bcl-2，促凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)的影響，探討EPO作為神經(jīng)保護(hù)劑是否能有效地抑制缺血再灌注損傷，抑制神經(jīng)元的凋亡，達(dá)到腦保護(hù)作用。 方法：實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、模型制備、評(píng)分及用藥同第一部分。HE染色觀察缺血神經(jīng)細(xì)胞壞死現(xiàn)象。細(xì)胞凋亡原位末端標(biāo)記(POD)法觀察神經(jīng)元凋亡情況。免疫組化SP法檢測(cè)Bcl-2、Caspase-3蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果：

14、HE染色：缺血再灌后6h缺血組缺血灶中心區(qū)大量神經(jīng)元消失，出現(xiàn)較多的紅色細(xì)胞和鬼影細(xì)胞及少量形態(tài)完全的可逆性受損細(xì)胞，病灶周圍以可逆性受損細(xì)胞及正常細(xì)胞為主，伴輕度炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；缺血再灌后24h缺血組出現(xiàn)明顯的缺血壞死，病灶中心區(qū)神經(jīng)細(xì)胞脫失更明顯，范圍較6h增大，梗塞血管周圍大片空泡區(qū)，提示嚴(yán)重腦水腫，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)也較前明顯。EPO組與相應(yīng)缺血組相比，壞死區(qū)縮小，神經(jīng)元受損減輕。 細(xì)胞凋亡：缺血再灌后6小時(shí)在基底節(jié)區(qū)梗塞灶的邊

15、緣有少量TUNEL染色陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞；缺血再灌后24小時(shí)基底節(jié)區(qū)梗塞灶擴(kuò)大，其邊緣可見大量凋亡細(xì)胞，皮層亦可見凋亡細(xì)胞。缺血組缺血再灌后6小時(shí)和24小時(shí)凋亡細(xì)胞數(shù)分別為9.08±0.85和19.05±1.55；缺血再灌后6小時(shí)和24小時(shí)，EPO組凋亡細(xì)胞數(shù)分別為6.75±1.06和12.55±1.78與缺血組相比均顯著減少(P＜0.05)。對(duì)照組和假手術(shù)組未見細(xì)胞壞死和細(xì)胞凋亡。 Bcl-2表達(dá)：缺血再灌注后6小時(shí)可見Bcl-2

16、陽(yáng)性細(xì)胞彌散分布于基底節(jié)和皮層；缺血再灌注后24小時(shí)其數(shù)量減少。缺血組缺血再灌注后6小時(shí)和24小時(shí)的Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為27.50±1.44和10.93±1.84。缺血再灌后后6小時(shí)和缺血后24小時(shí)，EPO組Bcl-2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為33.63±1.71和20.99±1.50，與缺血組相比均顯著增加(P＜0.05)。對(duì)照組和假手術(shù)組未見明顯Bcl-2表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞。 Caspase-3表達(dá)：缺血再灌注后6小時(shí)可見Caspas

17、e-3陽(yáng)性細(xì)胞彌散分布于基底節(jié)和皮層；缺血再灌注后24小時(shí)其數(shù)量增加。缺血組缺血再灌注后6小時(shí)和24小時(shí)的Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為18.38±1.93和46.07±2.02。缺血再灌注后6小時(shí)和缺血后24小時(shí)，EPO組Caspase-3陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分別為10.22±1.20和27.41±2.71，與缺血組相比均顯著減少(P＜0.05)。對(duì)照組和假手術(shù)組未見明顯Caspase-3表達(dá)陽(yáng)性細(xì)胞。 結(jié)論：研究結(jié)果表明EPO作為