促紅細(xì)胞生成素抗心肌缺血再灌注損傷的實驗研究.pdf

1、一.EPO抗乳鼠心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的實驗研究 目的：建立乳鼠心肌細(xì)胞H/R模型,觀察EPO對心肌細(xì)胞H/R損傷的保護作用,揭示EPO抗心肌細(xì)胞H/R損傷的機制,探討其作用的信號通路. 方法 1.進行乳鼠心肌細(xì)胞的原代分離純化,建立細(xì)胞H/R模型.實驗分組包括空白組,對照組,EPOL組,EPOM組,EPOH組,U0126組.2.MTT法檢測細(xì)胞存活率:比色法檢測上清液L,DH,CK-MB.3.TUNEL法及An

2、nexin-V-FITC流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率.4.TBA法測定細(xì)胞內(nèi)MDA含量,黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性.5.Western法測定細(xì)胞ERK<,1/2>及磷酸化ERK<,1/2>蛋白含量. 結(jié)果 1.H/R損傷導(dǎo)致心肌細(xì)胞膜通透性增加,存活率下降,凋亡率增加,MDA含量升高,SOD活性降低,而一定濃度的EPO顯著減少心肌酶的釋放,提高心肌細(xì)胞活性,減輕細(xì)胞凋亡,提高SOD活性.2.各組ERK<,1/2>蛋白的表達(dá)

3、總量無明顯差異:而在H/R損傷和外源性EPO的作用下,磷酸化ERK<,1/2>蛋白含量增加. 結(jié)論 EPO在體外對心肌細(xì)胞H/R損傷有一定的保護作用,與其抑制心肌細(xì)胞凋亡,減少氧自由基生成有關(guān),且可能是通過啟動ERK<,1/2>通路信號轉(zhuǎn)導(dǎo)進行. 二.Langendorff模型下EPO抗心肌缺血再灌注損傷的實驗研究 目的：建立Langendorff離體心臟灌注模型,觀察不同劑量的EPO預(yù)處理對離體心臟血流

4、動力學(xué)等指標(biāo)的影響,評價EPO對MIRI的保護作用,通過檢測凋亡相關(guān)基因的蛋白表達(dá),測定炎癥因子mRNA含量變化,探討EPO對MIRI保護作用的分子生物學(xué)機制。 方法：1.建立Langendorff離體心臟灌注模型,分組包括,空白組,對照組,EPOL組,EPOM組,EPOH組.2.記錄心功能參數(shù):HR,LVSP,±dp/dt<,max>,及CF.3.檢測冠脈流液中 LDH,CK 含量.4.免疫組化法檢測Bax,Bc1-2, NF

5、-к B P65的蛋白表達(dá).5.熒光實時定量PCR法測定 TNF-α,IL-1β,ICAM-1的mRNA水平. 結(jié)果 1.MIRI對心功能有負(fù)性影響,心肌酶釋放增加:一定濃度的EPO增加心肌收縮力,改善心肌舒張功能,擴張冠脈血管.2.MIRI誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡,而EPO能通過差異調(diào)節(jié)Bcl一2和Bax的蛋白表達(dá)抑制凋亡.3.心肌組織經(jīng)過MIRI后,NF-кB發(fā)生活化,致炎因子基因轉(zhuǎn)錄水平增高,而EPO能抑制相關(guān)作用.

6、 結(jié)論 一定濃度EPO對離體心臟的MIRI有保護作用,其機制與抑制心肌細(xì)胞凋亡,調(diào)控NF-кB的活化并減輕致炎因子介導(dǎo)的心肌炎癥反應(yīng)相關(guān). 三.在體模型下EPO抗心肌缺血再灌注損傷的實驗研究目的建立大鼠MIRI在體模型,記錄血流動力學(xué)指標(biāo),統(tǒng)計心律失常情況,測定血清心肌酶譜值,觀察心肌超微結(jié)構(gòu),研究EPO對大鼠MIRI的影響. 方法 1.建立大鼠MIRI在體模型,實驗分組包括:空白組,I/R組,EPO組

7、.2.連續(xù)心電監(jiān)測并記錄各時間點出現(xiàn)的心律失常.3.生物信號采集處理系統(tǒng)記錄HR,LVSP,±dp/dt<,max>.4.檢測血清AST,CK-MB,LDH.5.電鏡下觀察左心室組織超微結(jié)構(gòu). 結(jié)果 MIRI 誘導(dǎo)嚴(yán)重心律失常的發(fā)生率升高,心肌的收縮和舒張功能損傷,心肌酶釋放增加,并破壞細(xì)胞超微結(jié)構(gòu);而EPO降低心律失常發(fā)生率,改善心功能,減輕生物膜損傷,保護心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu). 結(jié)論：EPO對在體模型上的大鼠M