促紅細(xì)胞生成素后處理對大鼠再灌注損傷肺的保護(hù)作用及機(jī)制.pdf

1、目的:
　　探討外源性促紅細(xì)胞生成素后處理對再灌注損傷肺的保護(hù)作用及機(jī)制。
　　方法:
　　1.把40只實驗的雄性大鼠（體重200～250g）隨機(jī)分成5組，每組有8只:即假手術(shù)對照組（C組）、肺缺血/再灌注組(LIR組)、肺缺血/再灌注+促紅細(xì)胞生成素組(EPO組)、促紅細(xì)胞生成素+溶劑對照組1（0.4％DMSO的PBS溶液）（D組）、促紅細(xì)胞生成素+U0126（U組）。腹腔注射5％水合氯醛，麻醉后仰臥固定在鼠臺，予以

2、氣管插管，機(jī)械通氣，左側(cè)開胸，游離左肺門，動脈夾夾閉，復(fù)制在體大鼠原位單肺缺血/再灌注模型。C組游離左肺門后不夾閉肺門，觀察150min; I/R組游離并夾閉左肺門造成缺血30min，松開動脈夾再灌注120min;EPO組在再灌注同時尾靜脈注射促紅細(xì)胞生成素3000U/kg，其余操作同LIR組;D組缺血前給予7.5ml/kg體重的0.4％DMSO的PBS溶液，余同EPO組;U組缺血前尾靜脈注射ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的特異拮抗劑0.3m

3、g/kgU0126（0.3mgU0126溶于7.5m10.4％DMSO的PBS溶液）。
　　2.實驗后取頸動脈血檢測血清丙二醛(MDA)含量及超氧化物歧化酶(SOD)活性、髓過氧化物酶(MPO)活性等生化指標(biāo)的變化。
　　3.采用原位末端標(biāo)記法(TUNEL)檢測肺組織凋亡情況，并計算凋亡指數(shù)(AI)。
　　4.取肺組織測肺的濕/干重比(W/D)。
　　5.免疫組織化學(xué)、RT-PCR法測定肺組織Bcl-2、Bax及

4、Bcl-2mRNA、BaxmRNA表達(dá)。
　　6.在光鏡及電子顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)的改變，并測定肺損傷組織學(xué)定量評價指標(biāo)(IQA)。
　　結(jié)果:
　　1.與C組比較，LIR組血清SOD活力顯著降低，MDA含量、MPO活力顯著升高(P均＜0.01);EPO組、D組、U組與LIR組相比，MDA含量、MPO活力顯著降低，SOD活力升高(P＜0.05或P＜0.01);D組與EPO組比較兩者無明顯差異(P均＞0.05)，

5、U組與EPO組相比，SOD活力顯著降低，MDA含量、MPO活力顯著升高（P均＜0.01）。
　　2.與C組比較，LIR組肺組織W/D、IQA值顯著升高(P均＜0.01）;EPO組、D組、U組與LIR組相比，肺組織W/D、IQA值顯著降低(P均＜0.01）;D組與EPO組相比，W/D、IQA值無明顯差異(P均＞0.05），U組與EPO組相比，U組肺組織W/D、IQA值顯著升高（P均＜0.01）。
　　3.TUNEL法測得，LI

6、R凋亡指數(shù)顯著高于C組，D組、U組、EPO組AI顯著低于LIR組（P均＜0.01），D組與EPO組相比無明顯差異(P＞0.05），U組顯著高于EPO組。
　　4.免疫組化檢測各組肺組織Bcl-2、Bax蛋白顯示:在C組Bcl-2呈高水平表達(dá)、Bax表達(dá)不明顯，LIR組表達(dá)較C組Bcl-2表達(dá)明顯下降、Bax明顯上調(diào)，同時Bcl-2/Bax的比值降低（P均＜0.01）;與LIR組比較，D組、U組、EPO組Bcl-2蛋白表達(dá)增強(qiáng)，Ba

7、x表達(dá)減弱，Bcl-2/Bax的比值增高(P均＜0.01）;與EPO組相比，D組無明顯差異（P＞0.05），U組Bcl-2蛋白表達(dá)下降、Bax上調(diào)，同時Bcl-2/Bax的比值降低（P均＜0.01）。Bcl-2與Bax陽性細(xì)胞主要分布于血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺泡上皮細(xì)胞及支氣管上皮細(xì)胞。
　　5.RT-PCR檢測肺組織Bcl-2、Bax mRN顯示:在C組Bcl-2 mRNA呈高水平表達(dá)、Bax mRNA表達(dá)不明顯;LIR組較C組Bcl-

8、2 mRNA表達(dá)明顯下降、BaxmRNA明顯上調(diào)，同時Bcl-2/Bax的比值降低（P均＜0.01）;與LIR組比較，D組、U組、EPO組Bcl-2 mRNA表達(dá)增強(qiáng)，Bax mRNA表達(dá)減弱，同時Bcl-2/Bax的比值升高(P＜0.05或P＜0.01);與EPO組相比，D組無明顯差異（P＞0.05），U組Bcl-2 mRNA蛋白表達(dá)下降、Bax mRNA上調(diào)，同時Bcl-2/Bax的比值降低(P＜0.01)。
　　6.光鏡檢查

9、:C組肺間質(zhì)及肺泡細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本正常，未見明顯炎性細(xì)胞;LIR組肺組織出現(xiàn)彌漫改變，肺間質(zhì)水腫，肺泡內(nèi)可見較多紅細(xì)胞滲出，炎癥細(xì)胞浸潤，偶可見肺部實性變;D組、EPO組與LIR組比較，肺組織細(xì)胞損傷明顯減輕，肺間質(zhì)水腫減輕，肺泡內(nèi)紅細(xì)胞滲出減少，炎癥細(xì)胞聚集減少;U組肺組織細(xì)胞損傷較EPO組加重，炎癥細(xì)胞浸潤增多，肺泡內(nèi)紅細(xì)胞滲出增多，肺間質(zhì)水腫加重。
　　7.電鏡觀察發(fā)現(xiàn):C組肺泡Ⅰ型、Ⅱ型上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常;LI

10、R組肺內(nèi)毛細(xì)血管腔塌陷，肺泡腔中有大量滲出，巨噬細(xì)胞活躍，Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞水腫，吞飲小泡減少，細(xì)胞核固縮，核內(nèi)染色質(zhì)邊集，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞絨毛減少，線粒體水腫，線粒體脊消失，核膜擴(kuò)張，細(xì)胞核固縮，板層小體減少、空泡化并大量脫落到肺泡腔內(nèi);EPO組肺內(nèi)細(xì)胞損傷明顯減輕，毛細(xì)血管腔光滑，未見塌陷，血管內(nèi)皮細(xì)胞剝落減少，細(xì)胞核比較疏松，肺泡腔內(nèi)滲出減少，巨噬細(xì)胞活躍，Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞吞飲小泡增加，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞絨毛脫落減少，板層小體增加，線

11、粒體水腫減輕，線粒體脊可見;D組肺組織損傷明顯減輕，血管內(nèi)皮細(xì)胞輕度腫脹，肺泡腔內(nèi)滲出減少，巨噬細(xì)胞不活躍，Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞吞飲小泡增加，微絨毛及板層小體結(jié)構(gòu)未見明顯改變，肺泡隔較正常厚;U組肺組織損傷較EPO組加重，肺內(nèi)毛細(xì)血管腔內(nèi)部分塌陷，巨噬細(xì)胞活躍，肺泡腔內(nèi)有滲出，Ⅰ型肺泡上皮細(xì)胞吞飲小泡有減少，Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞絨毛有所減少。
　　結(jié)論:
　　促紅細(xì)胞生成素可能通過抑制中性粒細(xì)胞的激活、聚集，提高機(jī)體的抗氧化能力，激