斑馬魚bmal1b的生物鐘功能及其在生殖系統(tǒng)作用研究.pdf

1、生物鐘是生物機(jī)體內(nèi)存在得一種內(nèi)源性調(diào)控機(jī)制，它幾乎控制著機(jī)體的一切生命活動(dòng)。它在分子水平表現(xiàn)為鐘基因和鐘控基因的振蕩型表達(dá)，在多種生物中都有報(bào)道生物鐘基因的存在。目前，生物鐘轉(zhuǎn)錄-翻譯-負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制在很多物種中被證實(shí)存在。在生物鐘調(diào)節(jié)環(huán)路中，Bmal和Clock作為正性組分，編碼的蛋白質(zhì)BMAL和CLOCK可以異二聚化并結(jié)合基因的啟動(dòng)子區(qū)域E-box(CACGTG)序列，從而驅(qū)動(dòng)下游基因的表達(dá)。Per和Cry作為負(fù)性組分，可以被BMA

2、L-CLOCK復(fù)合體驅(qū)動(dòng)表達(dá)，它們編碼的蛋白PER和CRY可以結(jié)合BMAL-CLOCK復(fù)合體并抑制其轉(zhuǎn)錄激活作用，從而關(guān)閉自身及相關(guān)基因的表達(dá)。小鼠中有兩個(gè)Bmal，基因靶向研究表明在維持基因表達(dá)的節(jié)律和行為活力節(jié)律中，Bmal1比Bmal2更為重要。斑馬魚有三個(gè)bmal，為bmal1a、bmal1b、bmal2。它們?cè)谏镧姯h(huán)路中的作用仍未能被詳盡地研究。
　　本研究擬篩選ENU誘變的突變體獲得bmal1b基因純合突變體，通過檢

3、測(cè)突變體的鐘基因mRNA表達(dá)水平以及行為學(xué)檢測(cè)來分析bmal1b基因突變對(duì)斑馬魚造成的影響，從而確定它的功能。并且利用TALENs敲除bmal2基因并獲得純和突變體，為實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步研究bmal2奠定基礎(chǔ)。
　　研究結(jié)果:通過PCR擴(kuò)增和測(cè)序，成功建立了斑馬魚bmal1b基因的純和突變體;通過TALENs技術(shù)，成功建立了bmal2基因的突變體并篩選建立了三種純和突變體。通過熒光定量PCR檢測(cè)了bmal1b突變體主要鐘控基因的表達(dá)水平

4、，發(fā)現(xiàn)per1a、per1b、cry1ab等基因的表達(dá)量明顯下調(diào)。行為學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在正常光暗條件下和恒暗條件下，bmal1b突變體的活動(dòng)量高于野生型，與clock1a基因敲降的結(jié)果相一致，表明斑馬魚bmal1b基因在核心生物鐘環(huán)路中具有重要作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)bmal1b突變體的產(chǎn)卵能力同野生型相比較弱，激素含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)了突變體的雌二醇含量明顯低于野生型。生殖相關(guān)基因定量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)雌二醇合成決定基因cyp19a1a在bmal1b突變體中表達(dá)顯著