斑馬魚(yú)生物鐘基因per2突變體的構(gòu)建及在生物鐘系統(tǒng)中的功能分析.pdf

1、生物鐘作為內(nèi)在的記時(shí)機(jī)制，對(duì)于整個(gè)生物體的生理和行為都起著重要的作用。根據(jù)流行病學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，生物鐘的紊亂經(jīng)常導(dǎo)致免疫、生理、神經(jīng)等方面的疾病，甚至癌癥的發(fā)生。在生物體內(nèi)，生物鐘的分子機(jī)制主要是靠轉(zhuǎn)錄/翻譯的環(huán)路形成24小時(shí)的振蕩。在哺乳動(dòng)物中，首先CLOCK:BMAL1蛋白復(fù)合體作為正向的調(diào)節(jié)因子通過(guò)作用于靶基因啟動(dòng)子區(qū)域的E-box激活負(fù)向調(diào)節(jié)因子和生物鐘調(diào)控基因。負(fù)向調(diào)節(jié)因子Per和Cry轉(zhuǎn)錄后形成異二聚體PER:CRY進(jìn)入細(xì)胞核

2、內(nèi)與正向轉(zhuǎn)錄因子相互作用，解除了CLOCK:BMAL1的轉(zhuǎn)錄激活作用，從而完成了一個(gè)周期的進(jìn)行。哺乳動(dòng)物的Per2作為重要的負(fù)向調(diào)節(jié)因子，在生物鐘系統(tǒng)起著不可或缺的作用。斑馬魚(yú)作為一種重要的生物鐘研究模式生物已經(jīng)有二十幾年的歷史，由于其突變體的缺乏，極大地限制了斑馬魚(yú)在生物鐘領(lǐng)域的研究。TALEN作為一種最近興起的基因組編輯技術(shù)，在斑馬魚(yú)已經(jīng)得到較為廣泛地應(yīng)用。本研究主要內(nèi)容包括：
　?、爬肨ALEN技術(shù)成功構(gòu)建了斑馬魚(yú)per2

3、的突變體，并且分別得到了刪除11個(gè)堿基和插入13個(gè)堿基的兩種無(wú)效突變體。行為檢測(cè)表明，per2純合突變體在光暗條件下運(yùn)動(dòng)的活動(dòng)量降低，而在持續(xù)黑暗條件下，運(yùn)動(dòng)節(jié)律相位延遲。我們利用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)，體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)基因等方法研究發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚(yú)per2突變體中，褪黑素合成的限速酶基因（生物鐘控制基因）aanat2明顯的上調(diào)，生物鐘核心基因的表達(dá)也都發(fā)生了明顯的改變。例如，per1a、per1b、per3基因的表達(dá)在DD和LD條件下出現(xiàn)了

4、明顯的下調(diào)，cry1b、cry2a和cry2b在突變體中出現(xiàn)了明顯的上調(diào)，bma11b也出現(xiàn)了明顯的下調(diào)。轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Per2能夠通過(guò)E-box抑制aanat2的表達(dá)，能夠通過(guò)RORE來(lái)激活bma11b的表達(dá)，由此我們認(rèn)為per2在生物體內(nèi)具有雙重性的調(diào)節(jié)作用。進(jìn)一步利用利用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn)，Per2作用于bma11b是通過(guò)激活Rorα而不是通過(guò)Rev-erbα來(lái)起作用的。我們利用小鼠的系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)，同樣的現(xiàn)象在哺乳動(dòng)物也是存在，并且由魚(yú)類(lèi)

5、進(jìn)化到哺乳類(lèi)，Per2通過(guò)RORE來(lái)調(diào)節(jié)bma11基因的表達(dá)過(guò)程也發(fā)生協(xié)同進(jìn)化的過(guò)程。等斑馬魚(yú)生長(zhǎng)到性成熟，我們分別取了腦，肌肉，心臟和肝臟的組織，定量PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)per2在對(duì)生物鐘的調(diào)節(jié)過(guò)程中也是具有組織特異性的。由此說(shuō)明了per2在斑馬魚(yú)生物鐘和小鼠一樣也是起著重要作用的。
　?、茖?duì)per2在斑馬魚(yú)的代謝、生殖和發(fā)育中的作用進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在斑馬魚(yú)per2突變體中，相對(duì)于野生型，在突變體中出現(xiàn)了體長(zhǎng)、體重的降低，說(shuō)明pe

6、r2對(duì)于斑馬魚(yú)的生長(zhǎng)和代謝調(diào)節(jié)是有作用的。然后我們測(cè)定成魚(yú)體內(nèi)的性激素結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在per2純合突變體內(nèi)睪酮和雌二醇的濃度都出現(xiàn)了明顯的降低。定量PCR發(fā)現(xiàn)，在per2突變體內(nèi)雄性激素轉(zhuǎn)化為雌性激素催化酶（芳香酶）基因cyp19a的表達(dá)出現(xiàn)了明顯的改變。對(duì)于斑馬魚(yú)兩個(gè)cyp19a基因啟動(dòng)子的甲基化程度調(diào)查發(fā)現(xiàn)，甲基化程度在突變體中明顯地升高。由此生物鐘per2的紊亂影響到了芳香酶基因的甲基化格局從而造成了per2突變體生殖的改變。