Skiv2l2通過與Clock和Bmal結(jié)合正向調(diào)控斑馬魚生物鐘.pdf

1、地球上大多數(shù)生物體呈現(xiàn)以大約24小時為周期的生物節(jié)律,它由生物體內(nèi)源的生物鐘產(chǎn)生并維持。生物鐘對諸如體溫、睡眠周期、代謝及激素分泌等多種基本的生理過程以及行為都具有調(diào)控作用。因此,對生物鐘的分子機制及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行研究,有助于解釋人體正常的生理生化過程和行為,并且對防治由生物鐘紊亂所引發(fā)的相關(guān)疾病具有十分重要的意義。作為重要的模式生物之一,斑馬魚是研究脊椎動物生物鐘分子機制的理想模型。和小鼠與果蠅類似,斑馬魚生物鐘機制是基于Clock:

2、Bmal異二聚體和Per:Cry復(fù)合體的轉(zhuǎn)錄/翻譯負(fù)反饋調(diào)節(jié)環(huán)路。除了這些核心生物鐘基因之外,研究發(fā)現(xiàn)許多基因產(chǎn)物具備調(diào)節(jié)生物鐘的功能。然而,其他調(diào)節(jié)因子如何在斑馬魚生物鐘調(diào)控中發(fā)揮作用等重要問題尚缺乏深入研究。在粗鏈脈孢霉中,RNA解旋酶FRH與FRQ蛋白形成復(fù)合體 FFC并且抑制WCC介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄激活作用。目前的研究表明 FRH是粗鏈脈孢霉生物鐘中重要的調(diào)節(jié)因子,但是其具體的調(diào)節(jié)機制則尚未完全闡明。通過系統(tǒng)樹分析,我們發(fā)現(xiàn)斑馬魚 sk

3、iv2l2與粗鏈脈孢霉 frh屬于同源基因。先前的研究表明該基因在斑馬魚幼魚的黑色素細(xì)胞再生中起作用。然而,skiv2l2是否參與生物鐘調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以及具體調(diào)控機制尚未有相關(guān)研究。
　　本研究通過分子生物學(xué)和生物化學(xué)方法手段探討skiv2l2在斑馬魚生物核心環(huán)路中的功能。熒光定量實時PCR顯示skiv2l2的mRNA在斑馬魚幼體和成魚肝臟中呈現(xiàn)明顯的節(jié)律表達(dá);此外,mRNA水平在bmal1b突變體中其表達(dá)下調(diào),但在per1b突變體中上

4、調(diào)。對skiv2l2的啟動子進(jìn)行序列分析發(fā)現(xiàn),其啟動子擁有E-box順式元件;螢光素酶檢驗顯示Clock1a:Bmalb異二聚體能夠增強skiv2l2啟動子的轉(zhuǎn)錄活性,而Cry1.1a則抑制其活性;染色質(zhì)免疫沉淀實驗發(fā)現(xiàn)Bmal1b能夠結(jié)合skiv2l2啟動子中的E-box順式元件。這些結(jié)果表明生物鐘直接調(diào)控skiv2l2的表達(dá)。盡管skiv2l2純合突變體因魚鰾缺陷難以運動,skiv2l2雜合子突變體則體態(tài)正常。行為檢測發(fā)現(xiàn)skiv2

5、l2雜合突變體游泳節(jié)律異常;核心鐘基因per1a、per1b、per2、per3、cry1.1a、cry1.1b、cry1.2a、cry1.2b以及鐘控基因annat2和pck1等在skiv2l2純合子突變體表達(dá)降低。這些結(jié)果表明,skiv2l2在斑馬魚生物鐘調(diào)控環(huán)路中起到不可或缺的作用。同時,體外細(xì)胞轉(zhuǎn)染實驗表明Skiv2l2的過表達(dá)能夠激活Bmal1b:Clock1a介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄;免疫共沉淀實驗表明 Skiv2l2能夠與 Clock1