IgA腎病扁桃體細胞上清對腎系膜細胞及小管細胞的影響.pdf

1、IgA腎病(IgAN,IgA nephropathy)是一類以腎小球系膜區(qū)IgA沉積為主要特征的疾病，是最常見的原發(fā)性腎炎之一。病因不明，預(yù)后不佳，目前仍缺乏有效的治療方法，每年約有1～2％的IgAN患者進入終末腎衰竭，需要腎臟替代治療。加之本病好發(fā)于青少年，男多于女，給國家和個人帶來了沉重的經(jīng)濟和社會負擔(dān)。因此，對其病因和發(fā)病、疾病進展機制的研究成為全世界醫(yī)學(xué)工作者尤其是廣大腎病學(xué)者關(guān)注的熱點之一。
　　 IgAN患者TMCs

2、在PHA刺激后的分泌產(chǎn)物除了對扁桃體自身免疫產(chǎn)生調(diào)節(jié)作用，是否會對人腎臟固有細胞，如腎小球系膜細胞和腎小管上皮細胞的生長與分化產(chǎn)生影響，與非IgAN的慢性扁桃體炎患者比較是否有明顯差異，目前尚未見報道。前期的研究發(fā)現(xiàn)IgAN患者的外周血單個核細胞(periferal blood monouclear cells,PBMCs)培養(yǎng)上清與腎小球系膜細胞共培養(yǎng)可以上調(diào)ICAM-1表達，TMCs培養(yǎng)上清與系膜細胞共培養(yǎng)，較非IgAN慢性扁桃體炎

3、患者，可以上調(diào)系膜細胞TGF-β1，PAI-1，IL-6的表達。單一的細胞因子作用研究很多，但體內(nèi)環(huán)境復(fù)雜，不同的細胞因子共存時可能出現(xiàn)多效、重疊、拮抗或協(xié)同的作用。因此，在IgAN中，為了以接近體內(nèi)的狀況來觀察TMCs及其產(chǎn)物在IgAN發(fā)病機制中的可能作用，我們收集IgAN和非IgAN慢性扁桃體炎患者手術(shù)切除的扁桃體，分離其中的TMCs并收集上清，直接作用于人腎小球系膜細胞(HMC)和人腎小管上皮細胞(HK-2)，并收集TMCs培養(yǎng)上

4、清與HMC共培養(yǎng)后的上清再作用于HK-2細胞，觀察這兩種腎臟固有細胞間的相互聯(lián)系及不同細胞培養(yǎng)上清液對人腎小球系膜細胞和腎小管上皮細胞的增殖與分化作用上的差異，并初步探討相關(guān)可能機制，探索扁桃體免疫在IgAN發(fā)病、疾病進展中的可能作用。本研究共分為兩部分。
　　 第一部分 IgA腎病患者TMCs培養(yǎng)上清對人腎小球系膜細胞凋亡及相關(guān)機制研究
　　 目的：
　　 觀察IgA腎病患者TMCs培養(yǎng)上清對人腎小球系膜細胞凋

5、亡的影響及相關(guān)機制，探討IgA腎病TMCs分泌產(chǎn)物在IgA腎病中的可能作用。
　　 方法：
　　 收集13例IgAN和非IgAN CT患者手術(shù)摘除的右側(cè)扁桃體，分離TMCs進行體外培養(yǎng)；各組病人均分PHA刺激和未刺激兩小組培養(yǎng)，PHA體外刺激TMCs72小時，收集PHA刺激和未刺激的細胞培養(yǎng)上清液；將PHA刺激和未刺激的IgAN和非IgAN CT患者TMCs混合培養(yǎng)上清按所需濃度與人腎小球系膜細胞共培養(yǎng)24小時，流式細胞

6、儀測定系膜細胞凋亡率，RT-PCR檢測系膜細胞Bcl-2，Bax，F(xiàn)as mRNA的表達；應(yīng)用ELISA檢測PHA刺激和未刺激的TMCs培養(yǎng)上清液中的TGF-β1水平。
　　 結(jié)果：
　　 PHA刺激的IgAN患者TMCs上清與人腎小球系膜細胞共培養(yǎng)后，與陰性對照組、PHA刺激的非IgAN CT組、未刺激的IgAN和非IgANCT組相比，系膜細胞的凋亡率明顯升高(P＜0.05)。系膜細胞的Bcl-2/β-actin mR

7、NA下調(diào)至陰性對照組的25％，Bax/Bcl-2比值增加至陰性對照組的4.3倍，與陰性對照組、PHA刺激的非IgAN CT組、未刺激的IgAN和非IgAN CT組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。IgA腎病患者TMCs PHA刺激的上清亦可使Fas/β-actin mRNA表達增加至陰性對照組的2.38倍，與陰性對照組、未刺激的IgAN和非IgAN CT組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。IgA腎病患者TMCs培養(yǎng)上清液中T

8、GF-β1表達水平較非IgAN慢性扁桃體炎患者，明顯升高(P＜0.05)，但PHA刺激組與未刺激組兩組之間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.IgAN的TMCs體外PHA刺激的培養(yǎng)上清與人腎小球系膜細胞共培養(yǎng)后能促進系膜細胞的凋亡，此機制可能與其下調(diào)系膜細胞Bcl-2基因表達，增加Bax/Bcl-2比例，上調(diào)Fas基因表達有關(guān)。
　　 2.IgA腎病患者的TMCs培養(yǎng)上清液中TGF-

9、β1表達水平明顯升高，PHA體外刺激不能顯著誘導(dǎo)TMCs生成TGF-β1。IgAN患者TMCs培養(yǎng)上清液中的TGF-β1水平的高低可能與其增加系膜細胞凋亡率的作用無關(guān)。
　　 第二部分 IgA腎病患者TMCs培養(yǎng)上清對人腎小管上皮細胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)分化研究
　　 目的：
　　 觀察IgAN患者TMCs培養(yǎng)上清及其與人腎小球系膜細胞共培養(yǎng)后的相應(yīng)系膜細胞上清對人腎小管上皮細胞增殖、凋亡和轉(zhuǎn)分化的影響，探討IgA腎病

10、rMCs分泌產(chǎn)物在IgAN中的可能作用。
　　 方法：
　　 將PHA刺激和未刺激的IgAN和非IgAN CT患者TMCs培養(yǎng)上清按20％濃度加入培基與人腎小球系膜細胞共培養(yǎng)24小時，收集不同TMCs相應(yīng)的混合系膜細胞上清。不同濃度的TMCs培養(yǎng)上清及其相應(yīng)的系膜細胞上清與HK-2細胞共培養(yǎng)，在12小時，24小時，用MTT比色法檢測細胞增殖。TMCs培養(yǎng)上清及其相應(yīng)的系膜細胞上清按所需濃度與HK-2細胞共培養(yǎng)24小時，采

11、用流式細胞儀檢測HK-2細胞凋亡率的改變。采用RT-PCR檢測HK-2細胞Bcl-2，Bax，E-cadherin和α-SMA mRNA的表達，采用Western Blot檢測E-cadherin和α-SMA蛋白的表達。
　　 結(jié)果：
　　 PHA刺激的IgAN患者TMCs上清及其相應(yīng)的系膜細胞上清以20％的濃度加入培基與HK-2細胞共培養(yǎng)24小時后，與陰性對照組、PHA刺激的非IgAN CT組、未刺激的IgAN和非Ig

12、AN CT組相比，HK-2細胞的存活率明顯降低(P＜0.05)，細胞凋亡率顯著增加(P＜0.05)，且細胞存活率隨上清濃度的升高而降低，隨作用時間的延長亦降低。PHA刺激的IgAN患者TMCs上清與HK-2細胞共培養(yǎng)后，HK-2細胞的Bcl-2/β-actin mRNA下降至陰性對照組的40％，Bax/Bcl-2比值增加至陰性對照組的2.41倍，與陰性對照組、未刺激的IgAN和非IgAN CT組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。亦

13、可使HK-2細胞的E-cadherin/β-actin mRNA下降至陰性對照組的43％，與陰性對照組、未刺激的IgAN和非IgAN CT組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。并增加HK-2細胞的α-SMA mRNA表達，與陰性對照組、PHA刺激的非IgAN CT組、未刺激的IgAN和非IgAN CT組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。PHA刺激的IgAN患者TMCs相應(yīng)的系膜細胞上清與HK-2細胞共培養(yǎng)后，可使HK-2細胞的

14、Bcl-2/β-actin mRNA下調(diào)至陰性對照的47％，與陰性對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，并使Bax/Bcl-2比值增加至陰性對照組的2.23倍，與陰性對照組、PHA刺激的非IgAN CT組、未刺激的IgAN和非IgAN CT組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。亦可使HK-2細胞的E-cadherin/β-actin mRNA降低至陰性對照組的66％，并增加HK-2細胞的α-SMA mRNA表達，與陰性對照組

15、、PHA刺激的非IgANCT組、未刺激的IgAN和非IgAN CT組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在蛋白水平，PHA刺激的IgAN患者TMCs上清與HK-2細胞共培養(yǎng)后，HK-2細胞的E-cadherin/β-actin下降至陰性對照組的50％，與陰性對照組、未刺激的IgAN和非IgAN CT組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。并增加HK-2細胞的α-SMA蛋白表達，與陰性對照組比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。PH

16、A刺激的IgAN患者TMCs相應(yīng)的系膜細胞上清與HK-2細胞共培養(yǎng)后，HK-2細胞的E-cadhein/β-actin下降至陰性對照組的47％，并增加HK-2細胞的α-SMA蛋白表達，與陰性對照組、PHA刺激的非IgAN CT組、未刺激的IgAN和非IgAN CT組相比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 PHA刺激后的IgAN的TMCs培養(yǎng)上清及其相應(yīng)的系膜細胞上清與人腎小管上皮細胞共培養(yǎng)后，HK-