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1、目的:(1)摸索優(yōu)化大鼠腎小球系膜細(xì)胞(rGMC)原代培養(yǎng)的方法。(2)觀察紫癜腎I號(hào)方對(duì)體外培養(yǎng)rGMC在細(xì)胞增殖、活性氧(ROL)產(chǎn)生及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子(MIF)表達(dá)方面的影響,探討其在兒童HSPN治療中可能的作用機(jī)制,為進(jìn)一步優(yōu)化該方的配伍組成及提高中西醫(yī)結(jié)合在兒童HSPN診治中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法:(1)采用不同方法原代培養(yǎng)rGMC并行形態(tài)學(xué)和間接免疫熒光染色鑒定,摸索各種有
2、利于rGMC原代培養(yǎng)的方法與條件。(2)采用不同劑量的紫癜腎I號(hào)方水提液干預(yù)原代培養(yǎng)的rGMC,并以黃芪注射液為參照,比較各組培養(yǎng)細(xì)胞在細(xì)胞增殖及培養(yǎng)上清液SOD水平上的差別:采用紫癜腎I號(hào)方水提液及IFN-γ干預(yù)原代培養(yǎng)的rGMC,觀察二者對(duì)培養(yǎng)上清液TGF-βl水平的影響。(3)制備并采用不同濃度的紫癜腎I號(hào)方含藥血清干預(yù)體外培養(yǎng)的rGMC細(xì)胞株,觀察其在細(xì)胞增殖、培養(yǎng)上清液SOD值和活性氧清除單位及MIFmRNA表達(dá)水平上的差別。
3、 結(jié)果: (1)rGMC的原代培養(yǎng)與鑒定結(jié)果:培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)形態(tài)學(xué)及間接免疫熒光染色鑒定證明為rGMC。在培養(yǎng)方法上,采用“植塊”法可有效解決腎小球不貼壁的難題,且能降低成本、縮短培養(yǎng)周期;改良的消化傳代方法有助于減少操作中對(duì)細(xì)胞的損傷,并可增加細(xì)胞的回收量;換液操作中采用減少培養(yǎng)液用量,增加換液頻率及實(shí)行半量換液等方法更有利于原代培養(yǎng)rGMC的生長(zhǎng)增殖。 (2)不同條件下體外培養(yǎng)rGMC的OD值:在24h時(shí)點(diǎn)上,低
4、、中、高濃度紫癜腎I號(hào)方水提液組的OD值分別為(0.0568±O.0042)、(O.0362±0.0037)和(O.0362±0.0031),顯著低于對(duì)照組(0.0790±0.0047)及黃芪注射液組(0.0747±0.0058)(均p<0.01)。在48h時(shí)點(diǎn)上,低、中、高濃度紫癜腎I號(hào)方水提液組的OD值分別為(0.0780±0.0063)、(0.0712±0.0041)和(0.0731±0.0045),也顯著低于對(duì)照組(0.1260
5、±0.0054)及黃芪注射液組(0.0995±0.0046)(均p 6、位值:在24h時(shí)點(diǎn)上,低、中、高濃度紫癜。腎I號(hào)方水提液組的SOD值分別為[(18.143±5.078)U/m1]、[(22.765±3.146)U/m1]和[(29.157±1.969)U/m1],顯著高于對(duì)照組[(10.866±3.766)U/m¨(均p 7、2.353)U/m1],也顯著高于對(duì)照組[(18.230±2.693)U/m1](均p<0.01)在紫癜腎I號(hào)方含藥血清干預(yù)rGMC細(xì)胞株24h后,高濃度紫癜腎I號(hào)方含藥血清組的SOD值為[(50.993±L214)U/m1],顯著高于對(duì)照組[(46.696±2.093)U/ml]和低濃度紫癜腎I號(hào)方含藥血清組[(47.136±2.278)U/m1](均P 8、678±0.717)U/m1]、[(67.561±O.567)U/m¨及[(67.834±O.674)U/m1],顯著高于對(duì)照組[(65.934±1.174)U/m1](/KO.05,P(O.0l,/KO.01)。 (4)不同條件下細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的TGF-βl水平:在24h時(shí)點(diǎn)上,紫癜腎I號(hào)方水提液聯(lián)合IFN-Y組的TGF-Bl水平[(86.634±69.151)pg/m1]顯著低于IFN-Y組[(199.545±59.097 9、)pg/m1](PlO.05)。在48h時(shí)點(diǎn)上,與對(duì)照組[(153.561±50.978)pg/m1]相比,紫癜腎I號(hào)方水提液聯(lián)合IFN-Y組的TGF-β1水平[(67.766±59.649)pg/m1]有顯著下調(diào)(BiO.05)。(5)不同濃度紫癜腎I號(hào)方含藥血清條件下rGMC的MIFmRNA表達(dá)水平:低、中、高濃度紫癜腎I號(hào)方含藥血清組的MIF/GAPDH比值分別為:(16.902±6.794)、(10.039±4.201)及(3.
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