雙色熒光質(zhì)粒構(gòu)建及其在活細(xì)胞內(nèi)DNA MMR檢測中的應(yīng)用.pdf

1、錯配修復(fù)(mismatch repair，MMR)是DNA修復(fù)路徑中最重要的途徑之一，在細(xì)胞生命活動過程中對維持基因組穩(wěn)定性起到非常重要的作用,DNAMMR功能缺陷會誘發(fā)癌變。因而對各種細(xì)胞在不同生理和病理?xiàng)l件下DNA MMR活性進(jìn)行分析具有重要意義。
　　2004年美國德州大學(xué)孫魯浙教授所領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)在世界上首次提出以綠色熒光蛋白(EGFP)基因作為報(bào)告基因?qū)罴?xì)胞內(nèi)DNA MMR活性進(jìn)行分析的模型，并證實(shí)了其可行性。但該模型中所

2、構(gòu)建的EGFP異源底物存在不依賴于DNAMMR的非特異性表達(dá)，因而削弱了該模型檢測的精度和靈敏度。本實(shí)驗(yàn)室在原有模型的基礎(chǔ)上，經(jīng)過一系列的改良與摸索，探索出了一套全新制備單鏈以及EGFP異源底物的方法，該法很好的消除了原模型中潛在的EGFP背景值,簡化了實(shí)驗(yàn)流程，對原有模型的成熟和完善起到了很大的推動作用。本課題是基于實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，為了進(jìn)一步完善DNA MMR活性分析模型并將其應(yīng)用于毒理學(xué)而提出的，它旨在解決DNA MMR活性

3、檢測模型中作為參照標(biāo)準(zhǔn)紅色熒光蛋白與綠色熒光蛋白表達(dá)不同一的問題。擬通過雙順反子載體使EGFP和RFP位于同一基因鏈上，使表達(dá)同一化，從而解決原有模型中分別轉(zhuǎn)染兩種熒光質(zhì)粒所產(chǎn)生的紅綠熒光表達(dá)不同一的問題.
　　首先，在原有DNA MMR活性分析模型的基礎(chǔ)上，我們使用EGFP表達(dá)正常型的質(zhì)粒pGEM5Z(+)-EGFP(p111)和EGFP突變型不能正常表達(dá)綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pGEM5Z(+)-(m)EGFP(p189)為模板，設(shè)

4、計(jì)特異引物，擴(kuò)增出模板上EGFP片段，然后酶連入雙順反子真核表達(dá)載體pIRES2-Dsred2中。成功獲得了正常型的雙色熒光表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-IRES2-Dsred2(p197)和缺失型的雙色熒光表達(dá)質(zhì)粒p(m)EGFP-IRES2-Dsred2(p198)，經(jīng)酶切分析、測序以及細(xì)胞表達(dá)效果鑒定，p197能夠同時表達(dá)紅色和綠色熒光兩種蛋白，p198只能表達(dá)紅色熒光蛋白，綠色熒光蛋白的表達(dá)缺失。測序與野生型EGFP序列比對結(jié)果顯示，質(zhì)粒

5、p198中EGFP基因與p189中對應(yīng)序列無差別;質(zhì)粒p197中EGFP基因序列與p111中對應(yīng)序列也無差別，因而兩種質(zhì)粒可以很好的用于下步G-T錯配異源底物的構(gòu)建。
　　其次，以第一部分構(gòu)建的雙色熒光質(zhì)粒p197為材料，采用我們先前建立的體外制備單鏈DNA的辦法，利用新型缺刻酶Nb.BsrdⅠ和外源核酸酶ExonucleaseⅢ處理p197，我們獲取了高純度的ssDNA分子。我們將所獲得的p197編碼股高純度單鏈DNA與AseⅠ

6、線性化的p197以及p198進(jìn)行退火，對產(chǎn)物運(yùn)用plasmid-safe ATP dependent DNase的新型純化方法處理，高效的制備了優(yōu)質(zhì)的同、異源雙鏈分子，將所獲得的同、異源雙鏈分子轉(zhuǎn)染進(jìn)一株DNA MMR功能正常的細(xì)胞Hela和一株DNA MMR功能缺陷的細(xì)胞株HCT116中，對EGFP的表達(dá)情況運(yùn)用顯微鏡和流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示兩種細(xì)胞株的DNA MMR活性存在明顯的差別(P≤0.05)，初步顯示了雙色熒光質(zhì)粒

7、應(yīng)用于DNAMMR活性分析上的價(jià)值。
　　最后針對于構(gòu)建的雙色異源底物中潛在SV40啟動子啟動的EGFP非特異表達(dá)以及在單鏈DNA制備上的局限性，我們利用p111和p189為載體，以pIRES2-Dsred2為模板，PCR擴(kuò)增出IRES2-Dsred2片段，將其連入載體p111和p189EGFP基因下游，成功獲得了另一對雙色熒光重組質(zhì)粒p199和p200，經(jīng)酶切和細(xì)胞轉(zhuǎn)染效果鑒定，均與預(yù)期一致。新雙色熒光質(zhì)粒的成功構(gòu)建為解決原雙色