雙色熒光質(zhì)粒構(gòu)建及其在活細胞內(nèi)DNA MMR檢測中的應(yīng)用.pdf

1、錯配修復(mismatch repair，MMR)是DNA修復路徑中最重要的途徑之一，在細胞生命活動過程中對維持基因組穩(wěn)定性起到非常重要的作用,DNAMMR功能缺陷會誘發(fā)癌變。因而對各種細胞在不同生理和病理條件下DNA MMR活性進行分析具有重要意義。
　　2004年美國德州大學孫魯浙教授所領(lǐng)導的團隊在世界上首次提出以綠色熒光蛋白(EGFP)基因作為報告基因?qū)罴毎麅?nèi)DNA MMR活性進行分析的模型，并證實了其可行性。但該模型中所

2、構(gòu)建的EGFP異源底物存在不依賴于DNAMMR的非特異性表達，因而削弱了該模型檢測的精度和靈敏度。本實驗室在原有模型的基礎(chǔ)上，經(jīng)過一系列的改良與摸索，探索出了一套全新制備單鏈以及EGFP異源底物的方法，該法很好的消除了原模型中潛在的EGFP背景值,簡化了實驗流程，對原有模型的成熟和完善起到了很大的推動作用。本課題是基于實驗室前期研究的基礎(chǔ)上，為了進一步完善DNA MMR活性分析模型并將其應(yīng)用于毒理學而提出的，它旨在解決DNA MMR活性

3、檢測模型中作為參照標準紅色熒光蛋白與綠色熒光蛋白表達不同一的問題。擬通過雙順反子載體使EGFP和RFP位于同一基因鏈上，使表達同一化，從而解決原有模型中分別轉(zhuǎn)染兩種熒光質(zhì)粒所產(chǎn)生的紅綠熒光表達不同一的問題.
　　首先，在原有DNA MMR活性分析模型的基礎(chǔ)上，我們使用EGFP表達正常型的質(zhì)粒pGEM5Z(+)-EGFP(p111)和EGFP突變型不能正常表達綠色熒光蛋白的質(zhì)粒pGEM5Z(+)-(m)EGFP(p189)為模板，設(shè)

4、計特異引物，擴增出模板上EGFP片段，然后酶連入雙順反子真核表達載體pIRES2-Dsred2中。成功獲得了正常型的雙色熒光表達質(zhì)粒pEGFP-IRES2-Dsred2(p197)和缺失型的雙色熒光表達質(zhì)粒p(m)EGFP-IRES2-Dsred2(p198)，經(jīng)酶切分析、測序以及細胞表達效果鑒定，p197能夠同時表達紅色和綠色熒光兩種蛋白，p198只能表達紅色熒光蛋白，綠色熒光蛋白的表達缺失。測序與野生型EGFP序列比對結(jié)果顯示，質(zhì)粒

5、p198中EGFP基因與p189中對應(yīng)序列無差別;質(zhì)粒p197中EGFP基因序列與p111中對應(yīng)序列也無差別，因而兩種質(zhì)?？梢院芎玫挠糜谙虏紾-T錯配異源底物的構(gòu)建。
　　其次，以第一部分構(gòu)建的雙色熒光質(zhì)粒p197為材料，采用我們先前建立的體外制備單鏈DNA的辦法，利用新型缺刻酶Nb.BsrdⅠ和外源核酸酶ExonucleaseⅢ處理p197，我們獲取了高純度的ssDNA分子。我們將所獲得的p197編碼股高純度單鏈DNA與AseⅠ

6、線性化的p197以及p198進行退火，對產(chǎn)物運用plasmid-safe ATP dependent DNase的新型純化方法處理，高效的制備了優(yōu)質(zhì)的同、異源雙鏈分子，將所獲得的同、異源雙鏈分子轉(zhuǎn)染進一株DNA MMR功能正常的細胞Hela和一株DNA MMR功能缺陷的細胞株HCT116中，對EGFP的表達情況運用顯微鏡和流式細胞儀進行分析，統(tǒng)計結(jié)果顯示兩種細胞株的DNA MMR活性存在明顯的差別(P≤0.05)，初步顯示了雙色熒光質(zhì)粒

7、應(yīng)用于DNAMMR活性分析上的價值。
　　最后針對于構(gòu)建的雙色異源底物中潛在SV40啟動子啟動的EGFP非特異表達以及在單鏈DNA制備上的局限性，我們利用p111和p189為載體，以pIRES2-Dsred2為模板，PCR擴增出IRES2-Dsred2片段，將其連入載體p111和p189EGFP基因下游，成功獲得了另一對雙色熒光重組質(zhì)粒p199和p200，經(jīng)酶切和細胞轉(zhuǎn)染效果鑒定，均與預期一致。新雙色熒光質(zhì)粒的成功構(gòu)建為解決原雙色