基于DNA鏈替換反應(yīng)的單堿基突變檢測以及球狀核酸在細(xì)胞內(nèi)實驗中的應(yīng)用.pdf

1、在過去的幾十年中，DNA的研究和應(yīng)用遠遠超出了“遺傳物質(zhì)”這一概念范疇，尤其是DNA納米技術(shù)的發(fā)展吸引了大量研究者的注意力。DNA納米技術(shù)主要有兩個分支:靜態(tài)的和動態(tài)的DNA納米技術(shù)。在動態(tài)納米技術(shù)中，DNA鏈替換反應(yīng)是一項重要的研究領(lǐng)域，并且它已經(jīng)在DNA邏輯門，分子機器以及復(fù)雜的DNA納米“建筑”的構(gòu)建等應(yīng)用中發(fā)揮這重要的作用。另一方面球狀核酸探針是一種近年來新型的生物納米材料。通常這種材料由兩部分組成:球狀的納米金核心和核酸鏈外殼

2、。這種新型的探針具有許多優(yōu)異的物理化學(xué)性能，并極大地方便了體外以及細(xì)胞內(nèi)的檢測。綜上所述，本論文的研究內(nèi)容主要集中于DNA鏈替換反應(yīng)以及球狀核酸探針在活細(xì)胞實驗中的應(yīng)用。
　　第一部分內(nèi)容是基于DNA鏈替換反應(yīng)的單堿基突變檢測。遺傳信息的精確表達依賴于核酸序列的特異性互補配對，因此檢測核酸序列中的堿基突變對于遺傳疾病的診斷和醫(yī)藥學(xué)的發(fā)展具有重要意義。酶標(biāo)記法是一種常用的檢測DNA堿基突變的手段。但酶標(biāo)記試劑通常比較昂貴，而且某些酶

3、的反應(yīng)條件比較苛刻。升溫法(High-temperature)和化學(xué)變性(chemical denaturation)是也兩種常用的傳統(tǒng)的檢測手段，但是這兩種方法并不適用于存在多個雜交反應(yīng)的復(fù)雜體系，因此其應(yīng)用受到限制。近年來在DNA納米技術(shù)領(lǐng)域，一種基于粘性反應(yīng)末端(Toehold)的DNA鏈替換反應(yīng)成為新的研究熱點，并被廣泛應(yīng)用DNA邏輯門，分子器件的設(shè)計與構(gòu)建。更要的是此反應(yīng)在室溫下，且不需要酶的催化即可實現(xiàn)DNA鏈構(gòu)型和序列的重

4、組，而且動力學(xué)過程可控。因此，成為一個理想的檢測DNA鏈堿基突變的工具?；谝陨纤?，我們設(shè)計了一個包含兩步的，并由DNA-AuNP探針驅(qū)動的DNA鏈替換反應(yīng)，并借助石英微晶天平(QCM)這個測試平臺來檢測DNA序列片段中的單堿基突變。接下來我們在目標(biāo)鏈選擇了幾個任意位置并檢測單堿基突變并進行檢測。結(jié)果表明，在目標(biāo)鏈的任意位置上，不論是單堿基錯配，插入還是堿基缺失，都能準(zhǔn)確無誤地檢測出來。最后我們計算了該方法的檢測限。在該設(shè)計中，DNA

5、-AuNP探針能夠?qū)⒛繕?biāo)鏈釋放回溶液中，從而使得目標(biāo)鏈能夠循環(huán)往復(fù)地出發(fā)DNA鏈替換反應(yīng)，進而降低檢測限，提高監(jiān)測的靈敏度。該方法的檢測限被估算為22pM，比直接加入DNA連接鏈的策略檢測限低兩個數(shù)量級。
　　第二部分內(nèi)容是球狀核酸探針探測細(xì)胞對外源DNA降解活動。向細(xì)胞內(nèi)導(dǎo)入外源的DNA分子探針是一種檢測胞內(nèi)目標(biāo)分子的常用的策略。同時這種方法還經(jīng)常用來獲取與胞內(nèi)生理活動，疾病診斷，生物藥劑有關(guān)的信息。分子信標(biāo)，DNA鏈替換反應(yīng)工

6、作網(wǎng)絡(luò)，DNA四面體納米結(jié)構(gòu)經(jīng)常用來構(gòu)建探針。另一方面，DNA功能化納米金（球狀核酸）是一種近年來興起的新型的生物材料探針。帶有巰基修飾的DNA鏈可通過Au-S鍵連接到球狀的納米金上。其中DNA序列可以與目標(biāo)基因互補，而納米金是有效的熒光淬滅基團，因此帶熒光標(biāo)記的球狀核酸可以用來細(xì)胞內(nèi)的檢測。但是由于細(xì)胞的防御機制，外源的DNA很容易被細(xì)胞內(nèi)的酶降解，從而導(dǎo)致假陽性信號。因此在本工作中我們利用球狀核酸探針來檢測細(xì)胞對外源DNA的降解位點

7、和降解行為。以前的觀點認(rèn)為外源的DNA在細(xì)胞內(nèi)被無規(guī)降解直至碎片化。然而本論文中的發(fā)現(xiàn)與之前截然不同。以MCF-7細(xì)胞為例，我們發(fā)現(xiàn)降解特定地發(fā)生在DNA鏈的5'端而且只有5'端的第一個核苷酸被酶切，而其余部分保持完好。此外，這個發(fā)現(xiàn)提供了一個避免降解引起的假陽信號的方法，即研究者可以將熒光團標(biāo)記到DNA鏈的安全區(qū)域。例如，檢測MCF-7細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)分子，熒光團可以被標(biāo)記到DNA鏈的3'或中間位置。同時我們希望這個發(fā)下能夠提供一些新的視

8、角去理解細(xì)胞內(nèi)的降解活動以增強DNA探針穩(wěn)定性。
　　MicroRNA是一類非編碼的小RNA片段。其通常能夠?qū)μ囟ǖ膍RNA起到負(fù)調(diào)節(jié)的作用，尤其是一些miRNA能夠抑制在癌細(xì)胞生長，分裂過程中起關(guān)鍵作用的mRNA的表達。因此miRNA也成為一種有前途的新型的抗癌試劑。本工作中，我們以microRNA-34a(miRNA-34a)為例，設(shè)計并合成了納米載體將miRNA-34a導(dǎo)入到細(xì)胞中，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。在這個設(shè)計中，surviv

9、in mRNA作為觸發(fā)鏈，通過兩步鏈替換反應(yīng)將miR-34a釋放到細(xì)胞中。利用檢測熒光信號的方法驗證上述設(shè)計原理。經(jīng)熒光光譜儀，共聚焦顯微鏡以及流式細(xì)胞儀的驗證，所設(shè)計的納米載體能夠?qū)iRNA-34a運輸?shù)郊?xì)胞中并成功地釋放出來。在這個反應(yīng)中，mRNA作為“觸發(fā)器”，最終導(dǎo)致miRNA-34a的釋放。這個設(shè)計能夠?qū)崿F(xiàn)mRNA抑制和miRNA-34a過表達同時發(fā)生。因此，我們利用qRT-PCR來表征此設(shè)計原理的效率。結(jié)果表明，實驗組中的