補(bǔ)腎法改善氧化應(yīng)激提高重復(fù)COS卵母細(xì)胞線粒體功能與調(diào)控Nrf2信號(hào)通路的關(guān)系.pdf

1、隨著不孕癥發(fā)病率逐年升高，體外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET）技術(shù)成為治療不孕癥的重要手段?？刂菩月殉泊碳ぃ╟ontrol ovarian stimulation, COS）是通過(guò)注射外源性促性腺激素調(diào)控卵巢內(nèi)多個(gè)卵泡同時(shí)發(fā)育的干預(yù)過(guò)程，是 IVF過(guò)程中關(guān)鍵步驟。單次移植的成功率很低，6個(gè)IVF-ET的累計(jì)活產(chǎn)率僅約65.3％，臨床上重復(fù)COS十分常見(jiàn)

2、。受精卵由精卵結(jié)合而成，卵母細(xì)胞作為來(lái)源于母親的生殖細(xì)胞，具有傳遞遺傳物質(zhì)，儲(chǔ)備營(yíng)養(yǎng)能量的重要作用。重復(fù)COS后顆粒細(xì)胞線粒體功能下降已被證實(shí)，影響線粒體功能的重要因素即氧化應(yīng)激狀態(tài)的存在。卵母細(xì)胞與顆粒細(xì)胞同處于卵泡中，線粒體作為卵母細(xì)胞胞質(zhì)中含量最為豐富的細(xì)胞器，為卵母細(xì)胞發(fā)育及早期胚胎發(fā)育提供能量，是評(píng)價(jià)卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟的重要指標(biāo)。卵母細(xì)胞線粒體是否受到影響值得研究。
　　課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎法能夠調(diào)節(jié)卵母細(xì)胞分泌因子表

3、達(dá)，提高卵母細(xì)胞質(zhì)量，并具有提高排卵障礙模型大鼠卵巢的抗氧化能力，降低氧化產(chǎn)物水平，改善卵巢功能的作用。本論文擬研究重復(fù)COS是否會(huì)造成卵巢氧化應(yīng)激狀態(tài)，觀察補(bǔ)腎法對(duì)重復(fù) COS后卵母細(xì)胞的影響及其作用機(jī)制，以期揭示補(bǔ)腎法通過(guò)改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，提高卵母細(xì)胞質(zhì)量，發(fā)揮調(diào)經(jīng)種子作用的可能機(jī)制，豐富“腎主生殖”的科學(xué)內(nèi)涵。
　　第一部分：補(bǔ)腎法對(duì)重復(fù)COS小鼠卵巢抗氧化應(yīng)激能力的影響
　　目的：研究重復(fù)COS對(duì)小鼠抗氧化酶活性、抗

4、氧化能力的影響及是否對(duì)卵巢組織蛋白、脂質(zhì)及核酸成分造成氧化損傷，并觀察補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方對(duì)重復(fù)COS后小鼠卵巢組織氧化損傷作用。
　　方法：
　　將40只8-10周齡雌性昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，每天早9:00陰道涂片觀察動(dòng)情周期，隨機(jī)分為4組，補(bǔ)腎高劑量組、補(bǔ)腎低劑量組、模型組及空白組，每組各10只。模型組及補(bǔ)腎高、低劑量組每日上午9:00分別灌胃蒸餾水及補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方，1mL/100g體重，連續(xù)10天。模型組及補(bǔ)腎各組于第11日同時(shí)腹

5、腔注射 PMSG10IU/只，48小時(shí)后腹腔注射 HCG10IU/只?？瞻捉M每日陰道涂片觀察動(dòng)情周期。重復(fù)以上過(guò)程3周期，每周期間隔4天。
　　模型組及補(bǔ)腎高、低劑量組小鼠在COS第3周期注射PMSG后46h，擬注射HCG前脫頸椎處死，將兩側(cè)卵巢摘除，迅速凍于液氮中保存。空白組在觀察到發(fā)情期后10h脫頸椎處死，摘取卵巢，液氮凍存。使用時(shí)將卵巢由液氮中取出，置于冰上，加 PBS勻漿，離心后取上清進(jìn)行檢測(cè)。采用ELISA試劑盒檢測(cè)8-

6、OHdG、AOPP、MDA、SOD、GSH-Px及T-AOC的水平。
　　結(jié)果：
　　1.各組卵巢組織8-OH-dG含量的比較
　　與正常組比較，補(bǔ)腎高劑量組卵巢組織8-OHdG含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），補(bǔ)腎低劑量組8-OHdG含量升高（P<0.05），模型組8-OHdG含量顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，補(bǔ)腎高劑量組、正常組8-OHdG含量顯著降低（P<0.01），補(bǔ)腎低劑量組8-OHdG含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)

7、差異（P>0.05）；補(bǔ)腎高、低劑量組之間比較，補(bǔ)腎高劑量組8-OHdG更低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2.各組卵巢組織AOPP含量的比較
　　與正常組比較，補(bǔ)腎高、低劑量組卵巢組織AOPP含量升高（P<0.05），模型組AOPP含量顯著升高（P<0.01）；與模型組比較，補(bǔ)腎高、低劑量組AOPP含量顯著降低（P<0.01），正常組AOPP含量顯著降低（P<0.01）。補(bǔ)腎高低劑量組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

8、（P>0.05）。
　　3.各組卵巢組織MDA含量的比較
　　補(bǔ)腎高、低劑量組與正常組卵巢組織MDA含量比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），模型組MDA含量明顯高于正常組（P<0.01）；與模型組比較，補(bǔ)腎高、低劑量組及正常組 MDA含量明顯降低（P<0.01）；補(bǔ)腎高、低劑量組之間比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　4.各組卵巢組織SOD活力的比較
　　補(bǔ)腎高、低劑量組卵巢組織SOD活力與正常

9、組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），模型組 SOD活力較正常組明顯降低（P<0.01）；與模型組比較，補(bǔ)腎高、低劑量組及正常組SOD活力明顯升高（P<0.01）；且補(bǔ)腎高、低劑量組SOD活力差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），補(bǔ)腎高劑量組SOD活力更高。
　　5.各組卵巢組織GSH-Px活力的比較
　　補(bǔ)腎高、低劑量組卵巢組織GSH-Px活力與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），模型組GSH-Px活力較正常組

10、顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，補(bǔ)腎高、低劑量組及正常組GSH-Px活力顯著增高（P<0.01）；補(bǔ)腎高、低劑量組之間比較，差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　6.各組卵巢組織T-AOC比較
　　補(bǔ)腎高低劑量組卵巢組織T-AOC水平與正常組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），模型組 T-AOC較正常組顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，補(bǔ)腎高、低劑量組及正常組T-AOC增高（P<0.05）。補(bǔ)腎高低劑

11、量組之間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　小結(jié)：
　　1.重復(fù)COS會(huì)提高小鼠卵巢組織核酸、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)的氧化損傷水平，影響小鼠卵巢中抗氧化酶的活性，造成小鼠卵巢組織的氧化應(yīng)激狀態(tài)。
　　2.補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方能夠降低重復(fù)COS小鼠卵巢組織的核酸、蛋白質(zhì)及脂質(zhì)的氧化損傷標(biāo)志物水平，提高小鼠卵巢組織抗氧化酶的活性，有助于消除重復(fù)COS對(duì)小鼠卵巢組織造成的氧化應(yīng)激狀態(tài)，糾正卵巢氧化/抗氧化失衡，調(diào)節(jié)機(jī)體至“陰平陽(yáng)秘”狀態(tài)

12、。
　　3.重復(fù)COS可能通過(guò)影響卵巢組織氧化應(yīng)激狀態(tài)進(jìn)而影響卵母細(xì)胞發(fā)育，降低卵母細(xì)胞質(zhì)量。補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方可通過(guò)糾正卵巢氧化應(yīng)激狀態(tài)，以改善卵母細(xì)胞質(zhì)量。其機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　第二部分：補(bǔ)腎法對(duì)重復(fù)COS小鼠卵母細(xì)胞線粒體功能的影響
　　目的：研究重復(fù)COS對(duì)小鼠卵母細(xì)胞ROS量及線粒體功能的影響，并觀察補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方對(duì)重復(fù)COS小鼠卵母細(xì)胞線粒體功能的作用。
　　方法：
　　將48只8-10周齡健康清潔級(jí)

13、雌性昆明小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)后，每天早9:00陰道涂片觀察動(dòng)情周期，隨機(jī)分為4組，補(bǔ)腎高劑量組、補(bǔ)腎低劑量組、模型組及空白組，每組各12只。模型組及補(bǔ)腎高、低劑量組每日上午9:00分別灌胃蒸餾水及補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方，1mL/100g體重，連續(xù)10天。模型組及補(bǔ)腎各組于第11日同時(shí)腹腔注射PMSG10IU/只，48小時(shí)后腹腔注射hCG10IU/只。空白組每日陰道圖片觀察動(dòng)情周期。重復(fù)以上過(guò)程3周期，每周期間隔4天。
　　模型組及補(bǔ)腎高、低劑量組小

14、鼠在超促排卵第3周期注射 HC G后14-16h，空白組于觀察到動(dòng)情期后12h，脫頸椎處死小鼠，剪開(kāi)腹壁，充分暴露后取出輸卵管，在PBS中清洗去血液，將輸卵管置于M16培養(yǎng)液中，用1mL注射器針頭劃破輸卵管膨大處，卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合物（COCs）溢出，透明質(zhì)酸酶消化，去除顆粒細(xì)胞后收集于無(wú)菌Ep管中，一部分液氮凍存檢測(cè)ROS水平；一部分立即送染色，激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)線粒體功能。
　　采用DCFH-DA染色，共聚焦顯微鏡觀察ROS水

15、平；采用Mito Tracker Red染色，共聚焦顯微鏡觀察卵母細(xì)胞線粒體分布；采用熒光素酶法檢測(cè)卵母細(xì)胞 ATP量；采用 JC-1染色，共聚焦顯微鏡觀察卵母細(xì)胞膜電位（MMP）；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)卵母細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)。
　　結(jié)果：
　　1.各組卵母細(xì)胞ROS水平的比較
　　與正常組卵母細(xì)胞ROS水平比較，補(bǔ)腎高、低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），模型組卵母細(xì)胞ROS水平較正常組顯著升高（P<0.01

16、）；與模型組卵母細(xì)胞ROS水平比較，補(bǔ)腎高、低劑量組均降低，其中補(bǔ)腎高劑量組降低顯著（P<0.01）；補(bǔ)腎高、低劑量組間比較，高劑量組ROS水平較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。
　　2.各組卵母細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)比較
　　與正常組比較，補(bǔ)腎高、低劑量組卵母細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），模型組mtDNA拷貝數(shù)較正常組顯著降低（P<0.01）；與模型組比較，補(bǔ)腎高劑量組 mtDNA明顯升高（P

17、<0.01），補(bǔ)腎低劑量組及正常組 mtDNA升高（P<0.05）；補(bǔ)腎高低劑量組之間比較，卵母細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　3.各組卵母細(xì)胞ATP含量比較
　　與正常組比較，補(bǔ)腎高、低劑量組卵母細(xì)胞 ATP含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），模型組 ATP含量較正常組下降（P<0.05）；與模型組比較，補(bǔ)腎高劑量組ATP含量升高明顯（P<0.01），補(bǔ)腎低劑量組及正常組ATP含量升高（P<0

18、.05）；補(bǔ)腎高、低劑量組之間比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　4.各組卵母細(xì)胞MMP強(qiáng)度的比較
　　與正常組比較，補(bǔ)腎高、低劑量組卵母細(xì)胞MMP平均強(qiáng)度差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），模型組MMP平均強(qiáng)度較正常組明顯降低，（P<0.01）；與模型組比較，補(bǔ)腎低劑量組 MMP強(qiáng)度升高（P<0.05），補(bǔ)腎高劑量組及正常組 MMP平均強(qiáng)度明顯增高，差異具有顯著性（P<0.01）；補(bǔ)腎高劑量組MMP平均強(qiáng)度高于低劑

19、量組（P<0.05）。
　　5.各組卵母細(xì)胞線粒體分布
　　補(bǔ)腎高/低劑量組、模型組及正常組卵母細(xì)胞線粒體均勻分布的比率分別為79.2%，73.9%，69%及80.9%?？ǚ綑z驗(yàn)結(jié)果顯示，補(bǔ)腎高/低劑量組及正常組線粒體均勻分布比率均高于模型組，但四組之間差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　小結(jié)：
　　1.重復(fù)COS會(huì)影響卵母細(xì)胞ROS水平、線粒體mtDNA拷貝數(shù)及MMP強(qiáng)度，影響卵母細(xì)胞ATP的水平，降低

20、卵母細(xì)胞質(zhì)量。
　　2.補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方能夠降低重復(fù) COS后卵母細(xì)胞 ROS水平，提高重復(fù)COS后卵母細(xì)胞線粒體mtDNA拷貝數(shù)、MMP強(qiáng)度及其ATP水平，改善重復(fù)COS后卵母細(xì)胞質(zhì)量，且高劑量補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方改善線粒體MMP強(qiáng)度的效果更優(yōu)。
　　3.補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方能夠提高重復(fù) COS后卵母細(xì)胞質(zhì)量與其改善卵母細(xì)胞線粒體功能有關(guān)，可作為治療臨床重復(fù) COS后卵母細(xì)胞質(zhì)量下降的輔助用藥。
　　第三部分：體外培養(yǎng)小鼠卵母細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化及

21、補(bǔ)腎法對(duì)體外培養(yǎng)氧化應(yīng)激狀態(tài)卵母細(xì)胞ROS水平及PB1排出率的影響
　　目的：研究體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中卵母細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，添加氧化劑 H2O2對(duì)卵母細(xì)胞ROS水平及 PB1排出率的影響，并觀察補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方對(duì)上述指標(biāo)的影響。
　　方法：
　　選用8只6-7周齡健康雌性SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)后每日灌胃補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方2次，1mL/200g體重（相當(dāng)于臨床等效劑量），連續(xù)3天。于第4日禁食12h后，一次性灌服全天劑量。給藥1h后

22、水合氯醛腹腔注射麻醉，股動(dòng)脈取血。室溫靜置2h后離心，留取血清，56℃水浴30min滅活補(bǔ)體，0.22μ m無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌，得到補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方含藥血清，-80℃保存?zhèn)溆谩?br>　　選用15只24-26日齡小鼠每只注射PMSG5IU促排卵，44h后脫頸椎法處死小鼠。消毒后分離完整卵巢，清洗去除血液及多余組織，置于預(yù)熱的M2培養(yǎng)液中，體視顯微鏡下使用注射器針輕柔撕裂卵巢組織，挑破較大有腔卵泡，選擇大小均一、包裹3-5層卵丘細(xì)胞的卵丘-卵母細(xì)

23、胞復(fù)合物（COCs），清洗后移入35mm培養(yǎng)皿中，添加2mL IVM培養(yǎng)液（α-MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%FBS+100mIU/mL rFSH+1.5 U/mLhCG+3ng/mL EGF+100IU/rnL青霉素+100μ g/mL鏈霉素）。培養(yǎng)皿置于37℃、5%CO2、100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
　　將收集的卵母細(xì)胞隨機(jī)分為3組分別培養(yǎng)。①正常組：IVM培養(yǎng)液培養(yǎng)至14-16h；②補(bǔ)腎組：IVM培養(yǎng)液添加10%補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方含藥血

24、清培養(yǎng)2h，再給予 H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)至14-16h；③H2O2組：IVM培養(yǎng)液培養(yǎng)2h，添加100μ M濃度H2O2，培養(yǎng)至14-16h。
　　倒置顯微鏡觀察COCs發(fā)育過(guò)程中形態(tài)學(xué)變化。將COCs置于吹打消化，脫去顆粒細(xì)胞后倒置顯微鏡下統(tǒng)計(jì)PB1排出率。DCFH-DA染料染色，共聚焦顯微鏡觀察ROS水平。
　　結(jié)果：
　　1.卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物在IVM培養(yǎng)過(guò)程中形態(tài)學(xué)變化
　　GV期COCs中，卵母細(xì)胞可見(jiàn)

25、透明帶，卵母細(xì)胞周圍可見(jiàn)多層、致密卵丘細(xì)胞包裹。IVM16-18h后，COCs體積增大，卵丘擴(kuò)張生長(zhǎng)并且結(jié)構(gòu)松散，中間可見(jiàn)卵母細(xì)胞輪廓。100U/mL透明質(zhì)酸酶消化培養(yǎng)后的COCs，移液器吹打消化，MⅠ期卵母細(xì)胞無(wú)第一極體排出，MⅡ期卵母細(xì)胞可見(jiàn)明顯卵周間隙，卵周間隙可見(jiàn)第一極體。
　　2.各組間卵母細(xì)胞ROS水平比較
　　與正常組比較，補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方組 ROS水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），H2O2組較正常組ROS水平

26、顯著升高（P<0.01）；補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方與H2O2組比較，卵母細(xì)胞ROS水平顯著降低（P<0.01）。
　　3.各組間卵母細(xì)胞PB1排出率的比較
　　統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與正常組比較，卵母細(xì)胞 PB1排出率補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），H2O2組卵母細(xì)胞PB1排出率較正常組顯著降低（P<0.01）；補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方組與 H2O2組比較，卵母細(xì)胞 PB1排出率顯著增高（P<0.01）。
　　小結(jié)：
　　1.在體外培

27、養(yǎng)卵母細(xì)胞培養(yǎng)液中添加H2O2可引起卵母細(xì)胞中ROS增加，PB1排出率降低，造成卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激模型。
　　2.體外培養(yǎng)卵母細(xì)胞培養(yǎng)液中添加補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方含藥血清可降低 H2O2引起的卵母細(xì)胞內(nèi)ROS的堆積，提高卵母細(xì)胞PB1排出率，提示補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方具有改善卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)，提高卵母細(xì)胞成熟率的作用。
　　第四部分：補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方對(duì)體外培養(yǎng)小鼠卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激初期Nrf2抗氧化應(yīng)激通路的影響
　　目的：研究體外培養(yǎng)小鼠卵母細(xì)

28、胞氧化應(yīng)激初期對(duì)Nrf2信號(hào)通路及下游抗氧化酶的影響，及添加補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方含藥血清培養(yǎng)對(duì)氧化應(yīng)激初期卵母細(xì)胞Nrf2信號(hào)通路及下游抗氧化酶的影響。
　　方法：選用24只6-7周齡健康雌性SD大鼠，制備補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方含藥血清，方法同第三部分。
　　選用60只24-26日齡昆明小鼠，機(jī)械法分離GV期卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合物，方法同第三部分。
　　將收集的卵母細(xì)胞隨機(jī)分為3組分別培養(yǎng)。①正常組：IVM培養(yǎng)液培養(yǎng)6小時(shí)；②補(bǔ)腎組：IVM培

29、養(yǎng)液添加10%補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方含藥血清培養(yǎng)4h，再給予H2O2，繼續(xù)培養(yǎng)至6h；③H2O2組：IVM培養(yǎng)液培養(yǎng)4h，添加100μ M濃度H2O2，培養(yǎng)至6h。
　　收集COCs，100U/mL透明質(zhì)酸酶中，吹打消化，脫去顆粒細(xì)胞，收集后一部分立即行免疫熒光檢測(cè)；一部分-80℃凍存用于RT-PCR檢測(cè)。
　　結(jié)果：
　　1.各組體外培養(yǎng)小鼠卵母細(xì)胞中PKC、Keap1、Nrf2、SOD、GSH-Px
　　mRNA的比較<

30、br>　　1.1.各組卵母細(xì)胞中PKC、Keap1、Nrf2 mRNA含量的比較
　　PKC mRNA表達(dá)：與正常組比較，H2O2組及補(bǔ)腎組PKC mRNA表達(dá)均顯著升高（P<0.01）；與H2O2組比較，補(bǔ)腎組PKC mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.01）。Keap1 mRNA表達(dá)：正常組、H2O2組及補(bǔ)腎組之間Keap1 mRNA表達(dá)比較，差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。Nrf2 mRNA表達(dá)：與正常組比較，H2O2組及

31、補(bǔ)腎組Nrf2 mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.01）；與H2O2組比較，補(bǔ)腎組Nrf2 mRNA表達(dá)升高（P<0.05）。
　　1.2.各組卵母細(xì)胞中Mn SOD及GSH-Px mRNA含量的比較
　　Mn SOD mRNA表達(dá)：與正常組比較，H2O2組Mn SOD mRNA表達(dá)升高（P<0.05），補(bǔ)腎組表達(dá)顯著升高（P<0.01）；與 H2O2組比較，補(bǔ)腎組Mn SOD mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.01）。GSH-Px

32、 mRNA表達(dá)：與正常組比較，H2O2組及補(bǔ)腎組GSH-Px mRNA表達(dá)均顯著升高（P<0.01）；與H2O2組比較，補(bǔ)腎組GSH-Px mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.01）。
　　2.各組體外培養(yǎng)小鼠卵母細(xì)胞中PKC、p-PKC、Keap1、Nrf2、p-Nrf2
　　蛋白表達(dá)的比較
　　PKC蛋白表達(dá)：各組之間卵母細(xì)胞中PKC蛋白表達(dá)差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；p-PKC蛋白表達(dá)：與正常組比較，H2O2

33、組p-PKC蛋白表達(dá)升高（P<0.05），補(bǔ)腎組表達(dá)顯著升高（P<0.01）；與 H2O2組比較，補(bǔ)腎組p-PKC蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01）。p-PKC/PKC表達(dá)：與正常組比較，H2O2組升高（P<0.05），補(bǔ)腎組顯著升高（P<0.01）；與H2O2組比較，補(bǔ)腎組顯著升高（P<0.01）。
　　Keap1蛋白表達(dá)：各組之間卵母細(xì)胞中Keap1蛋白表達(dá)差異均不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　Nrf2蛋白表達(dá)：與

34、正常組比較，H2O2組及補(bǔ)腎組Nrf2蛋白表達(dá)均升高（P<0.05）；H2O2組與補(bǔ)腎組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。p-Nrf2蛋白表達(dá)：與正常組比較， H2O2組及補(bǔ)腎組 p-Nrf2蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01）；與H2O2組比較，補(bǔ)腎組p-Nrf2蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.01）。p-Nrf2/ Nrf2比值：與正常組比較，H2O2組及補(bǔ)腎組p-Nrf2/ Nrf2比值顯著升高（P<0.01）；與H2O2組比較，補(bǔ)腎

35、組p-Nrf2/Nrf2顯著升高（P<0.01）。
　　小結(jié)：
　　1.氧化應(yīng)激可激活Nrf2信號(hào)通路，引起Nrf2 mRNA表達(dá)增加，及其下游抗氧化酶Mn SOD、GSH-Px的基因轉(zhuǎn)錄。
　　2.氧化應(yīng)激初期Nrf2蛋白活性升高與Keap1表達(dá)水平無(wú)明顯關(guān)系，可能與PKC提高Nrf2磷酸化水平，使其自Keap1解離有關(guān)。
　　3.補(bǔ)腎調(diào)經(jīng)方能夠減少氧化應(yīng)激后卵母細(xì)胞ROS水平，其機(jī)制可能與其調(diào)控氧化應(yīng)激初期P

36、KC-Nrf2信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，提高下游抗氧化酶基因轉(zhuǎn)錄有關(guān)。
　　結(jié)論：重復(fù)控制性卵巢刺激會(huì)引起卵巢抗氧化能力下降，抗氧化酶活性降低，氧化損傷產(chǎn)物增多，并影響卵母細(xì)胞線粒體功能，降低卵母細(xì)胞質(zhì)量。補(bǔ)腎法能夠改善重復(fù)COS后卵巢抗氧化能力，提高抗氧化酶活性，減少卵巢氧化損傷，并能夠改善卵母細(xì)胞線粒體功能，其機(jī)制可能是通過(guò)使卵母細(xì)胞內(nèi)PKC表達(dá)升高，激活Nrf2基因轉(zhuǎn)錄，提高Nrf2蛋白活性，誘導(dǎo)Nrf2信號(hào)通路下游抗氧化酶基因表達(dá)，提