水牛卵母細(xì)胞體外成熟與凋亡的初步研究.pdf

1、為進(jìn)一步完善水牛卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)體系，對(duì)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響因素，卯母細(xì)胞體外成熟和受精過程中的皮質(zhì)顆粒變化規(guī)律，以及體外成熟過程中卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的凋亡情況進(jìn)行了系統(tǒng)研究。本文分別以第一極體的排放和皮質(zhì)顆粒(cortical granules，CGs)單層分布于質(zhì)膜下作為水牛卵母細(xì)胞核、質(zhì)成熟的指標(biāo)對(duì)表皮生長因子(EGF)和胰島素樣生長因子(IGF-I)對(duì)水牛卵母細(xì)胞體外成熟的影響進(jìn)行了研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn):(1)在成熟基礎(chǔ)液中

2、添加10、20、30 ng/mL EGF對(duì)水牛卵母細(xì)胞的成熟率無明顯影響，但EGF濃度升高到50 n/mL時(shí)，水牛卯母細(xì)胞第一極體排出率顯著提高(55.4％vs 32.3％，P<0.05)，當(dāng)EGF濃度升高到100 ng/mL時(shí)，卵母細(xì)胞的成熟率下降；CGs的分布隨著EGF濃度的升高逐步由中間分布向皮層分布轉(zhuǎn)變，EGF濃度為50 ng/mL時(shí)皮層分布的卵母細(xì)胞比例最高，當(dāng)EGF濃度升高到100 ng/mL時(shí)，CGs又向中間分布轉(zhuǎn)變。(2

3、)在成熟液中添加10 ng/mL的IGF-I對(duì)水牛卵母細(xì)胞體外成熟無顯著影響(P>0.05)；但添加30 ng/mL的IGF-I能顯著提高水牛卵母細(xì)胞體外成熟率(P<0.05)，CGs的分布隨著IGF-I濃度的升高逐步由中間分布向皮層分布轉(zhuǎn)變，IGF-I濃度為30 ng/mL時(shí)，皮層分布的卵母細(xì)胞比例最高，隨著IGF-I濃度的進(jìn)一步升高(50、100 ng/mL)，CGs又向中間分布轉(zhuǎn)變。(3)成熟基礎(chǔ)液中添加20 ng/mL EGF+

4、30 ng/mL IGF-I的卵母細(xì)胞體外成熟率顯著高于添加20 ng/mL EGF組和對(duì)照組(P<0.05)。以上結(jié)果表明，適宜濃度的EGF和IGF-I對(duì)水牛卵母細(xì)胞體外成熟具有促進(jìn)作用，且兩者具有協(xié)同作用。 文中研究了水牛卵母細(xì)胞在體外成熟及體外受精過程中的CGs變化規(guī)律。用FITC-LCA標(biāo)記不同體外成熟時(shí)間、體外受精時(shí)間的水牛卯母細(xì)胞的CGs，然后用激光共聚焦顯微鏡檢測其分布情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CGs在水牛卵母細(xì)胞體外成熟培

5、養(yǎng)前，70.1％卵母細(xì)胞的CGs呈現(xiàn)中間分布，體外成熟16 h后，CGs呈皮層分布的卯母細(xì)胞比例增多，達(dá)到22.1％。培養(yǎng)24 h后，CGs皮層分布的卯母細(xì)胞達(dá)到59.8％，分布形式由完全聚合向完全分散逐步轉(zhuǎn)變。對(duì)不同體外成熟時(shí)間的卵母細(xì)胞進(jìn)行體外受精時(shí)發(fā)現(xiàn)，體外成熟12 h的卵母細(xì)胞僅在受精后3 h有12.9％的CGs外排。成熟20 h的卵母細(xì)胞在受精后1.5 h有48.5％的CGs外排，成熟24 h的卵母細(xì)胞受精后1.5 h的CGs

6、外排率可達(dá)到97.1％，3 h后達(dá)100％。同時(shí)也對(duì)化學(xué)激活后水牛卵母細(xì)胞的CGs分布情況進(jìn)行了測定，發(fā)現(xiàn)化學(xué)激活也可以引起CGs的排放，體外成熟12 h的卵母細(xì)胞僅在激活后3 h有10.O％的CGs外排。成熟20 h的卵母細(xì)胞激活后0.5 h沒有CGs外排，激活后1.5 h CGs外排僅達(dá)到33.3％，明顯低于受精。體外成熟24 h的卵母細(xì)胞在激活后1.5 h CGs外排率可達(dá)到96.7％。以上結(jié)果表明，隨著成熟時(shí)間的延長，CG的分布

7、由中間分布逐漸向皮層分布轉(zhuǎn)變，受精和激活后的CG排放速度與卵子本身的成熟度有著直接的關(guān)系，且化學(xué)激活引起的CGs排放速度比體外受精遲緩。研究了EGF和IGF-I對(duì)水牛卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)過程中凋亡的影晌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，(1)在成熟基礎(chǔ)液中添加不同濃度的EGF(10、20、30、50、100ng/mL)都可以降低卵母細(xì)胞的凋亡率；添加20 ng/mL EGF的卵母細(xì)胞凋亡率為10.9％，顯著低于對(duì)照組(29.4％，P<0.05)；隨著EGF濃度的

8、提高，卵母細(xì)胞的凋亡率隨之下降，當(dāng)EGF濃度添加至50 ng/mL時(shí)，卵母細(xì)胞凋亡率達(dá)到6.2％，顯著低于對(duì)照組和10 nggmL組(P<0.05)，與其它實(shí)驗(yàn)組無顯著差異(P>0.05)。(2)在成熟基礎(chǔ)液中添加10，30，50和100 ng/mL的IGF-I，卵母細(xì)胞凋亡率(8.2％，7.6％，10.6％和15.4％)均顯著低于對(duì)照組(36.4％，P<0.05)，其中100 ng/mL組的卵母細(xì)胞凋亡率顯著高于10ng/mL組和30

9、 ng/mL組(P<0.05)，其余各組間差異不顯著，(P>0.05)。(3)添加20 ng/mL EGF+30 ng/mL IGF-I組體外成熟卵母細(xì)胞的凋亡率低于添加30 ng/mL的IGF-I組和添加20 ng/mLEGF組以及對(duì)照組(P<0.05)。(4)在添加有20 ng/mL EGF+30 ng/mL IGF-I的成熟液中成熟培養(yǎng)12 h、20 h和24 h的的卯母細(xì)胞成熟率分別為7.8％、50.9％和61.4％，卵母細(xì)胞凋

10、亡率分別為1.7％、4.4％和4.7％，成熟差異顯著(P<0.05)，而凋亡率差異不顯著(P>0.05)。以上結(jié)果表明，適宜濃度的EGF和IGF-I可抑制水牛卵母細(xì)胞體外成熟過程中的凋亡發(fā)生，且兩者具有協(xié)同作用。 探討了卵母細(xì)胞發(fā)育潛能與卵丘顆粒細(xì)胞凋亡之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn):隨著卵母細(xì)胞成熟時(shí)間的延長，凋亡率升高；隨著卯母細(xì)胞評(píng)分和發(fā)育潛能的降低，顆粒細(xì)胞凋亡率逐漸升高。由此表明，卯母細(xì)胞發(fā)育潛能與卵丘顆粒細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。通過