WNT信號(hào)通路受體家族Frizzleds對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟的影響.pdf

1、Frizzled5在小卵泡(＜2mm)中的表達(dá)量明顯低于中型卵泡(2mm≤d≤5mm)和大型卵泡(＞5mm)(p＜0.05)，而在中型卵泡和大型卵泡中的表達(dá)量沒有明顯的差異(p＞0.05)。免疫組化顯色反應(yīng)檢測(cè)豬卵巢組織中Frizzled5蛋白的定位顯示，F(xiàn)rizzled5蛋白在卵母細(xì)胞膜、顆粒細(xì)胞中高表達(dá)，而在基質(zhì)中表達(dá)信號(hào)中等。以上結(jié)果揭示，WNT/Frizzleds信號(hào)通路可能對(duì)卵泡的發(fā)育和卵母細(xì)胞的成熟具有一定的作用。
　

2、　3.Frizzleds受體基因在豬卵母細(xì)胞體外成熟不同時(shí)期的表達(dá)
　　體外分別培養(yǎng)豬卵母細(xì)胞38-41h，44-46h，48-50h，觀察其成熟率和卵裂率。結(jié)果表明，培養(yǎng)44-46h時(shí)卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)質(zhì)量最好，其成熟率明顯高于培養(yǎng)38-41h和48-50h(p＜0.05)，其卵裂率明顯高于38-41h(p＜0.05)，而與培養(yǎng)48-50h比較，沒有明顯差異(p＞0.05)。由此證明培養(yǎng)時(shí)間過短或者過長(zhǎng)均會(huì)影響卵母細(xì)胞的體外成熟質(zhì)

3、量。
　　試驗(yàn)采用實(shí)時(shí)定量PCR法分析Frizzled2、Frizzled3、Frizzled4、Frizzled5和Frizzled7mRNA在不同培養(yǎng)時(shí)間卵母細(xì)胞中的相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果顯示，F(xiàn)rizzleds家族mRNA表達(dá)量隨培養(yǎng)時(shí)間發(fā)生變化，且趨勢(shì)不一致。Frizzled5在體外培養(yǎng)22h的卵母細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于培養(yǎng)0h和培養(yǎng)44h的表達(dá)量(p＜0.05)。Frizzled3在體外培養(yǎng)22h的卵母細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于

4、0h(p＜0.05)，但與培養(yǎng)44h時(shí)比較，沒有明顯不同(p＞0.05)。Frizzled2和Frizzled4在體外培養(yǎng)44h的卵母細(xì)胞中的表達(dá)量明顯高于其他兩個(gè)時(shí)期(p＜0.05)。Frizzled7在培養(yǎng)44h表達(dá)量明顯低于其他兩個(gè)時(shí)期(p＞0.05)。Frizzleds家族基因在卵母細(xì)胞中的動(dòng)態(tài)變化說明了WNT信號(hào)通路可能依賴不同的受體在卵母細(xì)胞成熟過程中發(fā)揮作用。
　　4.WNT-C59抑制劑對(duì)豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的影

5、響
　　豬卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)基中添加WNT信號(hào)通路小分子抑制WNT-C59，并對(duì)卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)進(jìn)行體外培養(yǎng)。采用實(shí)時(shí)定量PCR的方法測(cè)定Frizzled5與β-catenin在WNT-C59處理前后的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，體外添加1μM WNT-C59抑制劑濃度時(shí)，明顯提高了豬卵母細(xì)胞的成熟率（80.61％±2.07％）和卵裂(61.21％％±4.34％)(p＜0.05)。并且與對(duì)照組比較，WNT-C59處理組Fr

6、izzled5與β-catenin的mRNA表達(dá)產(chǎn)生明顯的下調(diào)(p＜0.05)。由此表明，WNT-C59可能通過Frizzled5下調(diào)WNT通路關(guān)鍵蛋白β-catenin的表達(dá)，來促進(jìn)豬卵母細(xì)胞的體外成熟和早期胚胎發(fā)育。
　　總之，試驗(yàn)檢測(cè)了WNT信號(hào)通路受體Frizzleds家族在豬卵巢中的表達(dá)，并篩選出表達(dá)量最高的受體Frizzled5。該基因在豬卵泡發(fā)育不同階段表達(dá)呈動(dòng)態(tài)變化，在顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞中高表達(dá)。表明WNT通路對(duì)于

7、卵泡發(fā)育和卵母細(xì)胞成熟具有重要的作用。Frizzleds家族在卵母細(xì)胞不同發(fā)育時(shí)期差異性表達(dá)，揭示了WNT信號(hào)通路可能依賴不
　　卵母細(xì)胞體外成熟(in vitro maturation，IVM)作為現(xiàn)代生物技術(shù)如體外受精、胚胎工程、轉(zhuǎn)基因克隆等技術(shù)的基礎(chǔ)，可充分利用哺乳動(dòng)物卵巢表面大量的未成熟卵泡中卵母細(xì)胞，改善胚胎體外生產(chǎn)效率，有助于提高動(dòng)物生產(chǎn)。但是，體外培養(yǎng)的成熟的豬卵母細(xì)胞經(jīng)體外受精以及細(xì)胞核移植后，胚胎發(fā)育都不如體內(nèi)發(fā)

8、育成熟的卵母細(xì)胞，其培養(yǎng)體系仍待進(jìn)一步完善。WNT信號(hào)通路在進(jìn)化中高度保守，在細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、干細(xì)胞維持以及胚胎發(fā)育等方面都具有重要的作用。有研究表明WNT信號(hào)在雌性性腺發(fā)育過程中扮演關(guān)鍵角色。但WNT信號(hào)通路對(duì)于豬等大型家畜卵母細(xì)胞體外成熟的作用和機(jī)理國(guó)內(nèi)外的研究很少。
　　本研究以豬卵母細(xì)胞為研究對(duì)象，探索WNT信號(hào)通路受體Frizzleds家族在豬卵巢中的表達(dá)與定位，篩選出豬卵巢中高表達(dá)量的受體。分析Frizzled

9、s受體家族在哺乳動(dòng)物豬卵母細(xì)胞中的時(shí)序表達(dá)，揭示W(wǎng)NT通路對(duì)于哺乳動(dòng)物卵母細(xì)胞發(fā)育的影響。同時(shí)，通過添加小分子抑制劑WNT-C59阻斷WNT上游通路檢測(cè)其對(duì)卵母細(xì)胞體外成熟培養(yǎng)的影響，從而為闡明豬卵母細(xì)胞體外成熟發(fā)育中WNT/Frizzleds信號(hào)通路的具體功能和機(jī)制提供參考。研究主要獲得如下結(jié)果:
　　1.WNT通路受體家族Frizzleds在豬卵巢中的表達(dá)差異
　　根據(jù)GenBank中所保存的豬的不同F(xiàn)rizzleds基

10、因序列，本試驗(yàn)運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)分析了Frizzled2-Frizzled7、Frizzled9和Frizzled10mRNA在豬卵巢相對(duì)表達(dá)水平。結(jié)果表明，卵巢組織中Frizzleds家族mRNA表達(dá)水平順序?yàn)?Frizzled5＞Frizzled7＞Frizzled4≥Frizzled3≥Frizzled2≥Frizzled6≥Frizzled9≥Frizzled10。即Frizzled5基因表達(dá)明顯高于其他Frizzleds家

11、族成員的表達(dá)量(p＜0.05)。其中，F(xiàn)rizzled7表達(dá)相對(duì)較高，明顯高于Frizzled9和Frizzled10(p＜0.05)。其他家族成員表達(dá)無明顯不同(p＞0.05)。Frizzled10幾乎未表達(dá)。試驗(yàn)由此揭示Frizzleds家族在豬卵巢中普遍表達(dá)并篩選出家族中表達(dá)量最高的受體Frizzled5。
　　2.Frizzled5受體在不同直徑卵泡的表達(dá)及其在豬卵巢上的定位
　　試驗(yàn)通過實(shí)時(shí)定量PCR和免疫組織化學(xué)