胚胎干細(xì)胞建系及造血分化潛能的研究.pdf

1、第一部分:小鼠胚胎干細(xì)胞建系及人孤雌胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)鑒定 第一章:小鼠胚胎干細(xì)胞建系 研究目的: 建立小鼠胚胎干細(xì)胞系，為下一步造血分化提供原材料。 材料與方法: 1.使用129/sv雌鼠和OG2公鼠進(jìn)行建系。OG2小鼠的特點(diǎn)是基因Oct4后溶合了基因GFP，所以在ES細(xì)胞在未分化的情況下能夠發(fā)出綠色熒光。 2.建系方法與常規(guī)建系過程一樣：取第3.5天孕鼠子宮，沖洗子宮獲得囊胚，并接種到飼

2、養(yǎng)層上；第4-6天后挑取克隆消化傳代。 結(jié)果: 我們將見栓后第3.5天的3只129/sv小鼠處死，取出子宮，沖洗后獲得16個(gè)胚胎，其中囊胚有9個(gè)，桑椹胚有5個(gè)，質(zhì)量比較差的胚胎（出現(xiàn)較多的碎片）有2個(gè)。由囊胚發(fā)育而來的成功建起2株細(xì)胞系，建系率為22%；桑椹胚的沒有成功建起細(xì)胞系。最后對(duì)其中一株細(xì)胞系進(jìn)行鑒定，結(jié)果都符合ES細(xì)胞的特性 結(jié)論: 我們建立的小鼠胚胎干細(xì)胞系符合ES細(xì)胞的特性，具有自我更新以及

3、多向分化的潛能。 第二章:人孤雌胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)以及鑒定 研究目的: 通過對(duì)人孤雌胚胎干細(xì)胞（phES cell）進(jìn)行培養(yǎng)鑒定，掌握人胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)技能，同時(shí)了解人孤雌胚胎干紹胞的一些生物學(xué)特性。 材料與方法: 1.由廣州醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院婦研所提供的人孤雌胚胎干細(xì)胞系。 2.傳代方法：使用膠原酶消化法和機(jī)械法。膠原酶消化法適合培養(yǎng)皿中克隆生長比較旺盛，狀態(tài)比較好的情況下；機(jī)械法適合于培養(yǎng)

4、皿中分化細(xì)胞比較多，或克隆比較少的情況。 3.我們對(duì)phES細(xì)胞進(jìn)行了Oct4、 SSEA-2、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81； EB形成試驗(yàn)；核型分析；STR以及畸胎瘤進(jìn)行檢測。 結(jié)果: 細(xì)胞能表達(dá)Oct4、 SSEA-2、SSEA-4、TRA-1-60、TRA-1-81等指標(biāo)；能夠形成EB；核型為45，XO；STR檢測顯示與供者～致；畸胎瘤到目前還沒有檢測出來。 結(jié)論: p

5、hES細(xì)胞的培養(yǎng)條件與正常人的ES細(xì)胞沒有明顯區(qū)別；通過檢測其生物學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)這株細(xì)胞的核型異常，而且致瘤性不強(qiáng)。 第二部分:胚胎干細(xì)胞的造血分化 第一章:核移植小鼠胚胎干細(xì)胞的造血分化潛能 研究目的: 對(duì)核移植來源的小鼠胚胎干細(xì)胞（NT-ES）進(jìn)行造血分化，探討它的造血分化潛能。 材料與方法: 1.F-ES細(xì)胞來源于129/sv雌鼠與OG2雄鼠交配見栓后第3.5天的囊胚，建系后穩(wěn)定傳代到

6、第18代時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)；NT-ES細(xì)胞來源于129/OG2小鼠睪丸的一種滋養(yǎng)細(xì)胞（Sertoli Cell）進(jìn)行核移植后建系獲得，同樣取第18代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。 2.分化過程中，采用預(yù)分化→初步分化→進(jìn)一步分化的步驟進(jìn)行造血分化。通過對(duì)分化過程中各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行比較，來說明兩者的異同。 3.造血移植：檢測由這兩株細(xì)胞分化而來的造血干細(xì)胞在體內(nèi)是否具有造血潛能。 結(jié)果: 1.EB形成能力：NT-ES和F-ES在總EB

7、和造血EB形成的數(shù)目分別是：129、134和73、78。 2.流式細(xì)胞儀分析結(jié)果：在分化的第6、7、10天，NT-ES細(xì)胞分化成CD34和Sca-1雙陽性細(xì)胞的比例分別為：6.58%、32.03%、23.44%；F-ES細(xì)胞的比例分別為：10.35%、32.88%、16.54%。 3.Realtime PCR檢測顯示，多個(gè)造血相關(guān)基因在兩者分化過程中的變化趨勢基本一致。 4.BL-CFC試驗(yàn)顯示，NT-ES細(xì)胞能

8、夠形成爆發(fā)集落。 5.造血移植檢測結(jié)果顯示：兩者在體內(nèi)都能夠發(fā)生造血。 結(jié)論 核移植來源的與受精來源的小鼠胚胎干細(xì)胞在體內(nèi)外幾乎具有一樣的造血分化潛能。 第二章:初步探討B(tài)MP4對(duì)人類胚胎干細(xì)胞造血分化的影響 研究目的: 初步探討B(tài)mp4在人類胚胎干細(xì)胞造血分化過程中的作用，為造血移植提供參考信息。 材料與方法: 1.由廣州醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院婦研所提供的hES1細(xì)胞株。

9、 2.實(shí)驗(yàn)分成3組：control組（只添加分化基礎(chǔ)培養(yǎng)基）、cytokine組（添加常規(guī)細(xì)胞因子）、Bmp4組（常規(guī)細(xì)胞因子+Bmp4），采用機(jī)械法進(jìn)行接種。將切成塊狀的克隆切片接種到超低吸附培養(yǎng)皿中（6孔板），每孔大概接種15-20塊克隆切片。 3.同時(shí)采用酶消化法與機(jī)械法進(jìn)行形態(tài)學(xué)的比較，看兩者在EB的發(fā)育上是否有區(qū)別。 結(jié)果: 1.流式細(xì)胞儀分析顯示，control組、cytokine組和Bmp4組分

10、化至第12天時(shí)，CD34+CD38-細(xì)胞的比例分別為1.63%、4.77%、9.83%； CD34+CD38+細(xì)胞的比例分別為1.48%、2.13%、2.80%； CD34+CD117+細(xì)胞的比例分別為3.09%、4.40%和9.91%。 2.control組、cytokine組和Bmp4組的造血集落形成數(shù)目分別為8、26、35。 3.用機(jī)械法處理后接種形成的EB，形態(tài)典型而且發(fā)育良好；酶消化法處理克隆后，不易于形成EB