牛胚胎干細(xì)胞建系因素的研究.pdf

1、胚胎干細(xì)胞具有潛在多能性和無(wú)限增殖能力，可在體內(nèi)或體外定向誘導(dǎo)分化為各種組織。建立牛胚胎干細(xì)胞系在組織工程、再生醫(yī)學(xué)、細(xì)胞及基因治療等基礎(chǔ)研究、生產(chǎn)實(shí)踐和臨床治療方面將有著廣闊的應(yīng)用前景。然而，在過(guò)去25年的時(shí)間里，分離和建立牛胚胎干細(xì)胞系卻遇到了很大挑戰(zhàn)。盡管有很多關(guān)于牛ES細(xì)胞的報(bào)道，但它們?cè)诩?xì)胞形態(tài)、多能性標(biāo)記等方面很大不同，且不具備真正的體內(nèi)和體外發(fā)育多能性，目前尚未有真正意義上的牛胚胎干細(xì)胞系的建立。 為了進(jìn)一步闡明牛

2、ES細(xì)胞多能性的維持機(jī)理，建立真正的、穩(wěn)定的牛ES細(xì)胞系，本論文對(duì)牛原代Es細(xì)胞的分離、鑒定以及培養(yǎng)條件進(jìn)行了系統(tǒng)探討。 首先，我們從牛囊胚中成功分離得到具有典型ES細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征并特異性表達(dá)AP、SSEA1、SSEA4、Oct4和Nanog等多能性標(biāo)記的牛原代ES細(xì)胞。并且發(fā)現(xiàn)Nanog蛋白在牛ES細(xì)胞、牛囊胚滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞質(zhì)都有表達(dá)，與其他物種僅在內(nèi)細(xì)胞團(tuán)和Es細(xì)胞的細(xì)胞核表達(dá)的情況有明顯差異。 通過(guò)對(duì)不

3、同來(lái)源的胚胎、飼養(yǎng)層細(xì)胞和血清等影響因素進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)采用體內(nèi)發(fā)育的囊胚為胚胎來(lái)源、以小鼠成纖維細(xì)胞為飼養(yǎng)層、在20﹪的KSR條件下有利于分離獲得原代牛ES細(xì)胞。而在隨后的培養(yǎng)傳代過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，38.6℃、5.6﹪CO<,2>的培養(yǎng)條件以及含20﹪FBS和4ng/ml bFGF的培養(yǎng)液更有利于牛ES細(xì)胞的自我更新及增殖。但這些改進(jìn)的分離方法和培養(yǎng)體系僅能維持牛ES細(xì)胞未分化的狀態(tài)到3～4代。此外，hLIF、ERK抑制劑PD98059、神經(jīng)

4、營(yíng)養(yǎng)因子(BDNT和NT4)以及黃嘌呤(Xs)不但未起到它們?cè)谄渌锓N來(lái)源的干細(xì)胞中維持自我更新及多能性的作用，反而促使牛ES細(xì)胞分化。有研究表明，氧化應(yīng)激能夠?qū)е录?xì)胞衰老并影響干細(xì)胞多能性。我們猜想抗氧化物是否能進(jìn)一步維持牛ES細(xì)胞未分化的狀態(tài)。然而，額外添加抗氧化劑卻無(wú)法進(jìn)一步保護(hù)ES細(xì)胞。 綜上，我們不僅成功分離得到具有典型形態(tài)特征的牛原代ES細(xì)胞，而且為牛ES細(xì)胞的分子鑒定提供了依據(jù)。更重要的是Nanog在牛ES細(xì)胞及牛