牛胚胎干細胞建系因素的研究.pdf

1、胚胎干細胞具有潛在多能性和無限增殖能力，可在體內(nèi)或體外定向誘導分化為各種組織。建立牛胚胎干細胞系在組織工程、再生醫(yī)學、細胞及基因治療等基礎(chǔ)研究、生產(chǎn)實踐和臨床治療方面將有著廣闊的應(yīng)用前景。然而，在過去25年的時間里，分離和建立牛胚胎干細胞系卻遇到了很大挑戰(zhàn)。盡管有很多關(guān)于牛ES細胞的報道，但它們在細胞形態(tài)、多能性標記等方面很大不同，且不具備真正的體內(nèi)和體外發(fā)育多能性，目前尚未有真正意義上的牛胚胎干細胞系的建立。 為了進一步闡明牛

2、ES細胞多能性的維持機理，建立真正的、穩(wěn)定的牛ES細胞系，本論文對牛原代Es細胞的分離、鑒定以及培養(yǎng)條件進行了系統(tǒng)探討。 首先，我們從牛囊胚中成功分離得到具有典型ES細胞形態(tài)學特征并特異性表達AP、SSEA1、SSEA4、Oct4和Nanog等多能性標記的牛原代ES細胞。并且發(fā)現(xiàn)Nanog蛋白在牛ES細胞、牛囊胚滋養(yǎng)外胚層和內(nèi)細胞團的細胞質(zhì)都有表達，與其他物種僅在內(nèi)細胞團和Es細胞的細胞核表達的情況有明顯差異。 通過對不

3、同來源的胚胎、飼養(yǎng)層細胞和血清等影響因素進行比較，發(fā)現(xiàn)采用體內(nèi)發(fā)育的囊胚為胚胎來源、以小鼠成纖維細胞為飼養(yǎng)層、在20﹪的KSR條件下有利于分離獲得原代牛ES細胞。而在隨后的培養(yǎng)傳代過程中發(fā)現(xiàn)，38.6℃、5.6﹪CO<,2>的培養(yǎng)條件以及含20﹪FBS和4ng/ml bFGF的培養(yǎng)液更有利于牛ES細胞的自我更新及增殖。但這些改進的分離方法和培養(yǎng)體系僅能維持牛ES細胞未分化的狀態(tài)到3～4代。此外，hLIF、ERK抑制劑PD98059、神經(jīng)

4、營養(yǎng)因子(BDNT和NT4)以及黃嘌呤(Xs)不但未起到它們在其他物種來源的干細胞中維持自我更新及多能性的作用，反而促使牛ES細胞分化。有研究表明，氧化應(yīng)激能夠?qū)е录毎ダ喜⒂绊懜杉毎嗄苄?。我們猜想抗氧化物是否能進一步維持牛ES細胞未分化的狀態(tài)。然而，額外添加抗氧化劑卻無法進一步保護ES細胞。 綜上，我們不僅成功分離得到具有典型形態(tài)特征的牛原代ES細胞，而且為牛ES細胞的分子鑒定提供了依據(jù)。更重要的是Nanog在牛ES細胞及牛